结果与分析：深入解读2.4.2

1.菌株16s rDNA序列扩增

CTAB法提取乳酸菌的DNA，结果如图2-15所示，各菌株基因组DNA均在15 000 bp之上，且条带清晰明亮，证明提取到符合实验要求的DNA，用于扩增乳酸菌的16s rDNA[12]。

图2-15　乳酸菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

M—DL15000bp DNA Marker；1—HBUAS51131；2—HBUAS51132；3—HBUAS51133；4—HBUAS51134；5—HBUAS51135；6—HBUAS51136；7—HBUAS51137；8—HBUAS51141；9—HBUAS51142；10—HBUAS51143；11—HBUAS51144；12—HBUAS51145；13—HBUAS51146；14—HBUAS51147；15—HBUAS51148

乳酸菌16s rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测的结果如图2-16所示，各泳道在1 500 bp左右的位置都出现了一条明显的亮带，证明各菌株目标片段均被成功扩增。用清洁试剂盒对PCR产物进行清洁，克隆后挑选阳性克隆子送往武汉天一辉远生物科技有限公司测序。

图2-16　乳酸菌16s rDNA的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图M—DL2000bp DNA Marker

2.乳酸菌16s rDNA序列及系统发育分析

测序后所得序列进行拼接，在NCBI上进行同源比对。与模式菌株相比，相似度大于99%的细菌判定为同种；相似度介于95%～99%判定为同属；相似度在91%～95%判定为同科[10]。恩施鲊广椒的15株乳酸菌与其对应的模式菌株相似度为99%或100%，表明乳酸菌均已鉴定到种的水平[13]。乳酸菌16s rDNA序列同源性比对分析结果如表2-12所示。

表2-12　乳酸菌16s rDNA 序列分析结果

续表

对恩施鲊广椒中的乳酸菌进行聚类分析，结果如图2-17所示。HUBAS51131、HUBAS51132、HUBAS51133、HUBAS51134、HUBAS51135、HUBAS51136、HUBAS51141、HUBAS51145、HUBAS51146和HUBAS51147等10株乳酸菌与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）模式菌株聚在一起；HBUAS51142、HBUAS51144和HBUAS51148等3株乳酸菌与发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）聚在一起；乳酸菌HBUAS51137与副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）聚在一起；乳酸菌HBUAS51143与食品乳杆菌（Lactobacillus alimentarius）聚在一起。由此可推断，L.plantarum为恩施鲊广椒中的优势菌，占菌株总数的66.67%。(www.xing528.com)

图2-17　乳酸菌16s rDNA序列系统发育树

3.基于电子鼻分析

鲊广椒不同时间的响应值分析如图2-18所示，传感器W1C（对芳香类物质灵敏）、W3C（对氨气、芳香类物质灵敏）和W5C（对烷烃、芳香类物质灵敏）的响应值呈下降趋势，传感器W1W（对有机硫化物、萜类物质灵敏）和W1S（对甲烷灵敏）响应值呈明显的上升趋势。

图2-18　不同时间鲊广椒的电子鼻传感器时间-强度动态响应

电子鼻有十根传感器，不同传感器对鲊广椒呈现不同的响应。由图2-18可知，不同时间传感器信号强度响应值的变化趋势：W1W对鲊广椒的响应值最高，W1S、W5S、W2S和W2W响应值次之，W2S、W6S、W3C、W5C和W1C响应值偏低。鲊广椒的信号强度在45～55 s趋于平稳，本研究选取49 s、50 s、51 s的测量数据作为参考值，取3个数据的平均值进行PCA分析。

PCA是将提取的传感器响应值信号进行数据转换和降维，对降维后的特征向量进行线性分类，PC1和PC2上包含了在PCA转换中得到的第一主成分和第二主成分的方差贡献率。方差贡献率越大，说明此主要成分可以较好地反映原来多指标的信息[14]。一般情况下，总贡献率超过70%～80%的方法即可使用[15]。基于电子鼻技术PC1和PC2的因子载荷图如图2-19所示。

图2-19　基于PCA的PC1和PC2的因子载荷图

由图2-19可知，第一主成分和第二主成分的贡献率总计达94.05%，基本能够反映原始数据的全部信息。第一主成分包括W1C、W1W、W6S、W2W、W3S、W2S和W1S，贡献率83.46%；第二主成分包括W5C、W3C、和W5S，贡献率为10.59%。基于电子鼻技术PC1和PC2的因子得分图如图2-20所示。

图2-20　基于PCA的PC1和PC2的因子得分图

由图2-20可知，添加乳酸菌组均分布于第一、二、三象限中，对照则处于第四象限。由此可知，添加乳酸菌组与对照组的差异性较大。与对照相比，添加乳酸菌组的鲊广椒芳香性物质含量更高，氮氧化物、氢化物、有机硫化合物和烷烃等物质含量显著降低。结合图2-19、图2-20分析可知，不同乳酸菌对鲊广椒的影响也存在较为显著的差异，乳酸菌HUBAS51132和HUBAS51141分布于第二象限，芳香类物质含量明显更高；乳酸菌HUBAS51134、HUBAS51147、HUBAS51133和HUBAS51131分布于第一象限，氢气、乙醇、烷烃、有机硫化物和萜类物质等物质含量更高。由此可见，利用HUBAS51132和HUBAS51141两株乳酸菌制作的鲊广椒芳香性更好。