采购于恩施市土桥坝菜市场高效实验：材料与方法详解

1.材料与试剂

样品：采购于恩施市土桥坝菜市场。

试剂：三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸二铵、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰和吐温80均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；D5625-01 DNA提取试剂盒：美国OMEGA公司；DNA marker（FERMENTAS）和PCR清洁试剂盒（AXYGEN）：京科博汇智生物科技发展有限公司；2PCR×mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq、dNTP mix、pMD18-T vector：大连宝生物技术有限公司（TaKaRa）；PCR引物合成和测序由武汉天一辉远生物科技有限公司完成。

2.仪器与设备

MiseqPE300高通量测序平台：美国Illumina公司；R920机架式服务器：美国DELL公司；CT15RE冷冻离心机：日本HITACHI公司；Veriti96-wellthermalcyclerPCR仪：美国AB公司；NanoDrop2000超微量分光光度计：美国ThermoFisher公司；DCodeTMSystem：美国BioRed公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；FluorChemFC3：美国FluorChem公司；Bio-5000plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；DG250厌氧工作站：英国DWS公司。

3.方 法

（1）样品总DNA提取与检测

采用OMEGA D5625-01试剂盒提取3个酸菜水样品中的总DNA，提取成功后用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测并测定其DNA的浓度。

（2）样品细菌16s rRNA PCR扩增及Miseq高通量测序

扩增体系为：4 μL 5×PCR缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，0.8 μL 5 μmol/L正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，0.4 μL 5 U/μL Taq酶，10 ng DNA模板，ddH2O补充至20 μL。其中引物为338F/806R。

扩增条件为：95 °C预变性3 min；95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸45 s，循环30次；72 °C延伸10 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后将浓度稀释至100 nmol/L，寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行Miseq高通量测序。

（3）序列拼接及质量控制(www.xing528.com)

下机序列参照王玉荣[14]和蔡宏宇[15]方法进行质控，同时使用QIIME（v1.7.0）分析平台进行生物信息学分析。使用PyNAST软件将所有的序列对齐后，采用两步UCLUST算法分别以100%和97%的相似度进行序列划分并建立分类操作单元（Operational Taxonomic Units，OTU），从每个OTU中选取1条代表性序列，使用RDP（Ribosomal Database Project）和Greengenes数据库对序列进行同源性比对，通过对数据的整理确定样品种属分类学地位，进而对酸菜水中的Chao1指数和Shannona指数等指标进行计算。将在3个样品中均存在的OTU定义为核心OTU。

（4）基于PCR-DGGE技术酸菜水中乳酸杆菌多样性解析

将（1）中DNA浓度调整一致后作为模板进行PCR扩增。乳杆菌16s rDNA基因片段PCR扩增所用的引物为：正向引物为LacF-GC（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’），反向引物为LacR（5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’）。PCR扩增体系为2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP（2.5 mol/L），0.5 μL正向引物（10 mmol/L），0.5 μL负向引物（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μL），1 μL DNA模板，ddH2O补充至25 μL。PCR反应条件为95 °C 4 min预变性，95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，30个循环，最后72 °C延伸 l0 min。PCR扩增结束后，扩增产物用2%的琼脂。

使用变性剂线性梯度为35%～52%，浓度为8%的聚丙烯酰胺（40%丙烯酰胺/N，N-亚甲基二丙烯酰胺）对样品DNA的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳。DGGE条件：点样量为10 μL，电泳液为0.5 TAE，电泳温度为60 °C，电压与时间为120 V，80 min，后80 V，13h。电泳结束后，对DGGE胶进行硝酸银染色[16]，使用扫描仪对凝胶电泳图进行观察拍照，并对优势条带进行切胶并回收。回收的条带用不含GC夹子的LacF和LacR引物进行扩增，扩增体系及条件与上述方法相同。将PCR扩增产物进行清洁纯化，并与PMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌TOP10中，经单克隆鉴定为阳性后送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。

将测序结果除去两端载体的序列，然后使用BioEdit软件将序列进行拼接。拼接结果在NCBI BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中比对查询，找出相似度高的相似序列用MEGA 5.0软件制作系统发育树。

（5）酸菜水中乳酸菌的分离与鉴定

将酸菜水样品进行倍比稀释（稀释度为10－5、10－6和10－7），涂布于含有1.5% CaCO3的MRS固体培养基上，置于厌氧工作站37 °C培养48 h。挑取有透明圈的菌落进行划线纯化，并进行革兰氏染色试验及菌株的保藏。CTAB[17]法提取各纯化菌株DNA，使用通用引物27F（5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和1495R（5’- CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’）进行16s rRNA扩增。

PCR扩增体系为：2.5 μL 10× PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP（2.5 mol/L），0.5 μL 27f（10 mmol/L），0.5 μL 1495r（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μl），0.5 μL DNA模板，ddH20补充至25 μL。

PCR扩增条件：95 °C 4 min预变性，95 °C变性 1 min，55 °C 1 min，72 °C 90 s，30个循环，72 °C延伸10 min。PCR扩增结束后，取扩增产物2.5µL用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。检测合格后，将PCR扩增产物进行清洁纯化，并与PMD18-T载体连接转化到大肠杆菌TOP10中，经单克隆鉴定为阳性后送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。

4.数据处理

通过Origin 8.5软件进行各项数据的统计并作图，热图由Matlab 2010b绘制，系统发育树由BioEdit软件和MEGA 5.0软件共同绘制。