基于Miseq高通量测序技术泡辣椒细菌多样性的研究

1.基于Miseq高通量测序技术泡辣椒细菌多样性的研究

本研究的3个泡辣椒共产生了131 480条16s rRNA高质量序列，平均每个样品产生43 826条。根据100%的相似性进行序列划分共得到78 050条代表性序列，根据序列的97%相似性进行OTU划分后，共得到8 879个OTU，每个样品平均2 959个OTU。使用RDP和Greengenes数据库对序列进行同源性比对，将所有的序列鉴定为10个门，18个纲，42个目，82个科和177个属。

在门水平上，3个泡辣椒样品中平均相对含量＞1%的细菌门分别为Firmicutes（硬壁菌门）和Proteobacteria（变形菌门），其相对含量分别为85.70%和12.59%。在属水平上，有10.88%的序列不能被鉴定，其中平均相对含量＞1%的属如图2-1所示。

图2-1　泡辣椒样品中平均相对含量＞1%的细菌属

由图2-1可知，泡辣椒样品中平均相对含量＞1%的属为Lactobacillus（乳酸杆菌属）、Pediococcus（片球菌属）、Klebsiella（克雷伯菌属）、Weissella（魏斯氏菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）和Leuconostoc（明串球菌属），其平均相对含量分别为67.37%、7.69%、1.99%、1.16%、1.08%和1.02%。由此可知，隶属于Firmicutes的Lactobacillus为泡辣椒水中的优势属。

在OTU水平上，本研究进一步统计了OTU在3个样品中出现的频率，结果如图2-2所示。

图2-2　基于OTU水平的Venn图

由图2-2可知，3个泡辣椒样品共有23个核心OTU，仅占OTU总数的0.2%，但包含了95978条序列，占总序列数的73.0%。进一步研究发现，23个核心OTU中有8个OTU的相对含量＞1.5%，分别为OTU1140、OTU2282、OTU3351、OTU7763、OTU326、OTU227、OTU5266和OTU7746。本研究进一步将上述8个核心OTU构建了系统发育树，如图2-3所示。

由图2-3可知，OTU1140和OTU2282与L.acidifarinae（暂无中文翻译）聚为一类，OTU3351与L.namurensis（暂无中文翻译）聚为一类，OTU7763和L.parafarraginis（暂无中文翻译）聚为一类，OTU326与L.kisonensis（暂无中文翻译）聚为一类，OTU5266和OTU227与P.ethanolidurans（暂无中文翻译）聚为一类，OTU7746与L.acetotolerans（耐酸乳杆菌）聚为一类。

图2-3　相对含量＞1.0%OTU的系统发育树

2.基于PCR-DGGE测序技术泡辣椒乳酸菌多样性的研究

由于本研究Miseq高通量测序的靶点主要针对16s rRNA的V3～V4区，所以其引物通用性较强，在种属鉴定时通常仅将其鉴定到属水平。本研究进一步使用乳酸杆菌专用引物对样品中的乳酸杆菌属进行了扩增，并结合PCR-DGGE技术对其多样性进行了解析。泡辣椒样品中乳杆菌PCR-DGGE电泳图如图2-4所示。(www.xing528.com)

图2-4　泡辣椒样品中乳杆菌PCR-DGGE电泳图

由图2-4可知，在电泳图中共找到5条特异性条带，条带1、条带2和条带4是3个泡辣椒样品的共有条带，条带5存在于LJS01和LJS03样品中，但是各条带的亮度不一致，说明同种微生物在不同样品中的含量存在差异，而条带3只存在LJS03样品中。由此可见，不同泡辣椒样品间乳酸菌多样性存在一定差异，且LJS03样品中乳酸菌多样性较高。本研究进一步对各优势条带进行切胶回收和序列分析，结果如表2-2所示。

表2-2　泡辣椒乳杆菌DGGE比对结果

由表2-2可知，5个特异性条带与现有数据库中序列都具有较高的相似度（99%～100%）。条带L1为L.plantarum，条带L2为L.namurensis，条带L3为L.fermentum（发酵乳杆菌），条带L4为P.turukhanskensis（暂无中文翻译），条带L5为L.breris。由此可见，恩施地区泡辣椒中乳酸菌多样性较高，采用纯培养技术对其中蕴含乳酸菌菌种资源进行挖掘显得尤为必要。

3.泡辣椒中乳酸菌分离鉴定结果及系统发育分析

本研究进一步使用传统微生物培养方法对3个泡辣椒样品中的乳酸菌进行了分离鉴定。测序比对结果如表2-3所示。

由表2-3可知，3个泡辣椒中共分离14株乳酸菌，经16s rRNA基因序列鉴定发现7株为L.plantarum，2株为L.fermentum，3株为E.faecium（屎肠球菌），1株为L.farciminis（香肠乳杆菌），1株为L.alimentarius。将各菌株与数据库中的模式菌构建系统发育树，如图2-5所示。

表2-3　泡辣椒中16s rRNA基因序列比对结果

图2-5　系统发育树

由图2-5可知，系统发育树分为两大支，其中13株菌聚类在一个分支，LJS01-1、LJS01-3、LJS03-1、LJS03-5、LJS01-7、LJS01-6和LJS03-6与L.plantarum聚为一类，LJS01-4和LJS02-2与L.fermentum聚为一类，LJS02-1、LJS01-2和LJS02-4与E.faecium聚为一类，LJS03-2与L.farciminis聚为一类，而菌株LJS03-3与L.alimentarius聚类在另一分支上。