个泡辣椒样品均采购于恩施市土桥坝菜市场

1.材料与试剂

样品：3个泡辣椒样品均采购于恩施市土桥坝菜市场。

三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、N，N-亚甲基二丙烯酰胺均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司；D5625-01 DNA提取试剂盒、DNA marker、PCR清洁试剂盒：京科博汇智生物科技发展有限公司；2PCR×mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；rTaq酶、dNTP Mix、pMD18-T vector：大连宝生物技术有限公司（TaKaRa）；正向引物338F（加入7个核苷酸标签barcodes）和反向引物806R：由武汉天一辉远生物科技有限公司合成；PCR引物合成和测序由武汉天一辉远生物科技有限公司完成，引物信息表如表2-1所示。

表2-1　引物信息

2.仪器与设备

Miseq PE300高通量测序平台：美国Illumina公司；R920机架式服务器：美国DELL公司；CT15RE冷冻离心机：日本HITACHI公司；VeritiTM 96-well thermal cycler PCR仪、NanoDrop 2000/2000c：美国Thermo Fisher公司；DCodeTM System：美国Bio Red公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；Bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；DG250厌氧工作站：英国DWS公司。

3.方 法

（1）泡辣椒样品宏基因组提取与检测

采用OMEGA D5625-01试剂盒提取3个泡辣椒样品宏基因组，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测并用NanoDrop测定其DNA的浓度。

（2）泡辣椒样品细菌16s rRNA PCR扩增及Miseq高通量测序(www.xing528.com)

参照沈馨[17]的方法进行样品细菌16s rRNA PCR扩增及Miseq高通量测序，扩增体系为：4 μL 5×PCR缓冲液，2 μL dNTP mix，正反向引物各0.8 μL，Taq酶0.4 μL，DNA模板10 ng，无菌超纯水补充至20 μL。扩增条件为：95 °C预变性3 min；95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸45 s，30次循环；72 °C延伸10 min。其扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后将浓度稀释至100 nmol/L，寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行Miseq高通量测序。

（3）序列拼接及质量控制

参照周书楠[18]和吴燕燕[19]等人的方法，根据成对序列之间的重叠关系，将双端序列数据拼接成一条序列；其次根据barcode将所有序列划分到各个样品并对序列方向进行校正，最后切掉序列barcode和引物。使用QIIME（v1.7.0）分析平台对拼接及质控成功的序列进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）划分和物种鉴定（包括界、门、纲、目、科和属水平），并计算各分类单元的相对含量。

（4）泡辣椒中乳酸杆菌多样性解析

乳杆菌16s rRNA基因片段PCR扩增所用正向引物为LacF-GC，反向引物为LacR。PCR扩增体系：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP，正向引物、反向引物和rTaq各0.5 μL，1 μL DNA模板，无菌超纯水补充至25 μL。PCR扩增条件：95 °C预变性4 min，95 °C变性 30 s，55 °C退火 30 s，72 °C延伸30 s，循环30次，72 °C延伸10 min。扩增结束后，PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

采用变性剂梯度为35%～52%（8%的聚丙烯酰胺）的凝胶进行DGGE检测。在温度为60 °C的0.5 TAE缓冲液中进行电泳，上样量为10 μL，先120 V，80 min，后80 V，13 h。电泳结束后，对DGGE胶进行硝酸银染色，对凝胶电泳图进行观察扫描拍照并找出优势条带切胶回收。回收的条带用不含GC夹子的LacF和LacR进行扩增，扩增体系及条件与上述方法相同。将PCR清洁产物与PMD18-T载体连接后转化到感受态细胞中，经单克隆鉴定合格后送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。将测序结果除去两端载体的序列，然后使用BioEdit软件进行拼接，拼接后在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站中进行同源性比对。

（5）恩施泡辣椒中乳酸菌的分离与鉴定

将泡辣椒样品进行倍比稀释并涂布于含有碳酸钙的MRS固体培养基上，置于厌氧工作站恒温37 °C培养48 h。挑取有透明圈的菌落进行纯化、革兰氏染色和保藏。提取各菌株的DNA（CTAB法[22]），使用正向引物27F和反向引物1495R进行16s rRNA扩增。在张鲁冀方法上稍作修改[23]，PCR扩增体系为：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP，正向引物、反向引物、rTaq和DNA模板各0.5 μL，无菌超纯水补充至25 μL。PCR扩增条件：95 °C预变性 4 min，95 °C变性1 min，55 °C退火1 min，72 °C延伸90 s，30个循环，72 °C延伸10 min。PCR扩增结束后，取扩增产物2.5 µL用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR清洁产物按照（4）中的方法处理并对测定结果进行拼接和比对。

（6）数据处理

通过Origin 8.5软件对平均相对含量＞1%的细菌属进行柱状图的绘制，Venn图由在线网站（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）进行绘制。选取各菌株同源性相似度较高的序列与菌株原序列利用BioEdit软件和MEGA 5.0软件绘制系统发育树。