结果与分析报告

1.样品细菌PCR-DGGE分析

本研究首先采用PCR-DGGE技术对腊肉中细菌多样性进行研究，结果如图1-7所示。

图1-7　腊肉样品中细菌DGGE分析结果

由图1-7可知，经变性梯度凝胶电泳后不同样品泳道中出现了数量、亮度不一的条带，本研究从中共挑选出9条优势条带，其中条带7和8为所有样品中共有条带，条带1、2、3和5为部分样品共有条带，而条带4和6分别为LR2和LR3中特有条带。由图1-7亦可知，条带7和8在所有样品中均较明亮，说明此处检测到的菌种在样品中均存在且含量较其他菌种多；与LR2、LR3、LR4和LR5相比，样品LR1中的条带数量及亮度要明显低一些，说明其细菌丰度较其他样品低。

由表1-3可知，各优势条带与其近源种的相似度均在99%以上。经比对，条带2、4、8和9分别为Staphylococcus equorum、Staphylococcus vitulinus、Staphylococcus condimenti和Staphylococcus vitulinus，均隶属于Staphylococcus（葡萄球菌属）；条带1和6分别为Psychrobacter arcticus和Psychrobacter faecalis，隶属于Psychrobacter（嗜冷杆菌属）；条带3和5分别为Lactobacillus plantarum subsp.argentoratensis和Lactobacillus amylovorus，隶属于Lactobacillus（乳酸杆菌属）；条带7为Pseudoalteromonas carrageenovora，隶属于Pseudoalteromonas（假交替单胞菌属）。结合图1-7分析结果可知，腊肉中细菌主要为Staphylococcus、Psychrobacter、Lactobacillus和Pseudoalteromonas且样品中都含有Staphylococcus condimenti和Pseudoalteromonas carrageenovora，而LR2和LR3中特有细菌分别为Staphylococcus vitulinus和Psychrobacter faecalis。全拓的研究表明葡萄球菌和微球菌是川渝两地腊肉产品货架期内优势菌，其次是乳酸菌，假单胞菌和肠杆菌数量较少[32]。这与本研究结果较为相似。

表1-3　优势条带比对分析结果

2.样品细菌MiSeq分析

采用MiSeq高通量测序技术从5个样品中检测到的序列在100%相似度下可划分为103 157条，在97%的相似度下又可将这些序列划分至8 876个OTU中，从各OTU中挑选代表性序列与数据库进行比对可判定其微生物学分类定位，分析结果如表1-4所示。

表1-4　样品序列微生物分类地位统计

注：*表示数据均在测序量为33 210条序列时计算所得。(www.xing528.com)

由表1-4可知，不同样本中检测到的细菌条带数量有所差异，经比对样品中各微生物分类水平数量亦不相同，LR4中条带数量和OTU最多，而LR3中微生物门、纲、目、科和属各级数量均较其他样品多。采用α多样性分析发现在条带数量为33 210条时超1指数和香农指数最大的为LR4，最小的为LR1，说明样品LR4中细菌总数及丰富度最高而LR1中最低，这与DGGE分析结果一致。本研究进一步在门水平分析样品中细菌信息，其相对含量如图1-8所示。

图1-8　细菌门水平相对含量分析

由图1-8可知，从5个腊肉样品中检测出Firmicutes（硬壁菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Deinococcus-Thermus（异常球菌-栖热菌门）、Fusobacteria（梭杆菌门）和Proteobacteria（变形菌门）等6个细菌门，其中平均相对含量大于1.0%的为Firmicutes和Proteobacteria且二者的累积平均相对含量高达99.11%。值得一提的是Deinococcus-Thermus为LR3特有细菌门，相对含量仅为0.60%；Fusobacteria为LR4中的特有细菌门，相对含量仅为0.41%。本研究进一步对99个细菌属中平均相对含量大于1.0%的细菌属进行分析，结果如图1-9所示。

由图1-9可知，腊肉中平均相对含量大于1.0%的细菌属及其平均相对含量分别为Staphylococcus（葡萄球菌属，40.18%）、Psychrobacter（嗜冷杆菌，24.02%）、Pseudoalteromonas（假交替单胞菌属，9.37%）、Brochothrix（环丝菌属，8.53%）、Cobetia（科贝特氏菌，4.71%）和Acinetobacter（不动细菌属，2.31%），仅有5.54%的序列不能鉴定到属水平。采用MiSeq高通量测序技术亦检测出Lactobacillus（乳酸菌属），其平均相对含量为0.27%，但PCR-DGGE未检测出隶属于Cobetia和Acinetobacter等菌属的细菌，可能与其扩增所用引物或这些菌属的丰度等因素有关。表1-4表明不同样品中OTU数量亦不相同，各OTU出现次数统计结果如图1-10所示。

图1-9　腊肉样品中优势细菌属分析图

由图1-10可知，仅出现1次的OTU即样品中特有OTU占总OTU数的80.26%，其所包含的序列有16 520条，占总序列数的7.36%；出现5次的OTU即5个样品中共有OTU仅占OTU总数的2.84%，但其所包含的序列有166 546条占OTU总数的74.22%，说明腊肉样品细菌菌群中部分为某些样品中特有的，但数量较少，含量最多的主要为共有细菌菌群。本研究将样品中共有且相对含量大于1.0%的OTU定义为核心优势OTU，其平均相对含量如图1-11所示。

图1-10　各OTU出现次数统计分析

图1-11　核心优势OTU相对含量分析

由图1-11可知，腊肉中核心优势OTU有16个，OTU5583、OTU5308、OTU8865、OTU7670、OTU1632、OTU2776、OTU1595、OTU367、OTU5460和OTU1519隶属于Staphylococcus，OTU687、OTU3304、OTU5538和OTU8970隶属于Psychrobacter，OTU4150和OTU514分别隶属于Pseudoalteromonas和Brochothrix。值得一提的是所有优势OTU中仅有OTU4150在LR4中的相对含量为0，说明腊肉样品中含有大量核心优势细菌菌群，且主要为Staphylococcus、Psychrobacter和Brochothrix。