材料与方法优化方案

1.材料与试剂

腊肉：恩施土家族苗族自治州农家自制。聚丙烯酰胺、尿素、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、过硫酸铵、冰醋酸、甲醛和硝酸银等化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取试剂盒，购于德国QIAGEN公司；5×FastPfu Buffer、10×PCR Buffer、dNTPs Mix、DNA聚合酶（5 U/μL）、pMD18-T载体，购自宝生物工程（大连）有限公司；6×Loading buffer、DL2000和DL15000 DNA Marker，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；2×PCR mix，购于南京诺唯赞生物科技有限公司；DGGE扩增引物ALL-GC-V3F（5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGCCT ACGGGAGGCAGCAG-3’）/ALL-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）和高通量测序引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）/806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’）等均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。Axygen清洁试剂盒，购于北京科博汇智生物科技发展有限公司；E.coli（大肠杆菌）Top10，由本实验室保藏。

2.仪器与设备

HBM-400B拍击式无菌均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；DYY-12电泳仪：北京六一仪器厂；VeritiTM96孔梯度PCR扩增仪：美国AB公司；PowerPacTMBasic稳压仪和DCodeTM System：美国BIO-RAD公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统：美国BIO-RAD公司；MiSeq PE300高通量测序平台：美国Illumina公司。

3.方 法

（1）样品前处理及宏基因组DNA提取

参照GB/T 4789.17—2003《食品卫生微生物检验肉与肉制品检验》进行取样，加入灭菌水225 mL混匀后300 r/min离心10 min取上清液，然后以10 000 r/min的速度将上清液离心10 min，保留沉淀。按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒使用说明中的方法提取样品总DNA并用微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度。(www.xing528.com)

（2）细菌PCR-DGGE指纹图谱分析

以提取的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系及反应参数参照文献26中的方法略做改动：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）4 μL，ALL-GC-V3F（10 μmol/L）和ALL-V3R（10 μmol/L）各1 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板1 μL，用无菌水将体系补齐至50 μL，混合均匀后置于PCR仪中94 °C预变性5 min；94 °C变性30 s，55 °C退火1 min，72 °C延伸90 s循环30次；然后72 °C完全延伸10 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。取10 μL扩增产物置于质量分数为8%、变性剂范围为35%～52%的聚丙烯酰胺凝胶中进行检测，电泳条件为：0.5×TAE缓冲溶液恒温60 °C，120 V运行78 min后80 V维持13 h。电泳结束后将银染法染色的凝胶扫描成像，挑选优势条带切胶回收，然后使用不带GC夹子的引物进行扩增，清洁，连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌Top10，挑选两株单菌落进行阳性克隆鉴定，并将菌液送至测序公司测

（3）细菌MiSeq高通量测序分析

参照沈馨[27]的方法进行PCR扩增：20 μL体系中5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTP mix（2.5mmol/L）2 μL，引物338F（5 μmol/L）和806R（5 μmol/L）各0.8 μL，rTaq（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板10 ng，剩余体积用无菌水补齐；反应参数为：95 °C，3 min；（95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，）30次循环；72 °C，10 min。扩增合格的产物寄出测序。序列下机后需进行拼接和质量控制，参照郭壮[28]的方法删除不合格序列后再根据各序列标签将序列划分至各样本中。利用QIIME数据分析平台[29]划分操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU），再从每个OTU中挑选代表序列于Greengenes[30]和RDP（Ribosomal Database Project）[31]数据库中进行比对，确定其微生物分类水平，并计算各样品α多样性。

（4）统计学分析

DGGE条带序列使用BioEdit 7.0.9进行拼接和引物切除，然后将处理好的序列置于NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上进行比对。根据各样品中发现序列数及OTU数，计算各样品的超1指数和香农指数，并使用OriginPro 2017绘图。