恩施市传统发酵食品微生物多样性材料及方法优化

1.材料与试剂

腊肠：采集自湖北省恩施市土桥坝和舞阳坝体育场菜市场；聚丙烯酰胺、冰醋酸、酚、尿素、过硫酸铵、四甲基乙二胺、硝酸银、甲醛、乙二胺四乙酸二钠、N,N-亚甲基二丙烯酰胺和氯仿：国药集团化学试剂有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取试剂盒：德国QIAGEN公司；Axygen清洁试剂盒：北京科博汇智生物科技发展有限公司；SolutionI、6×Loading buffer、DNA 聚合酶、dNTP mix、pMD18-T vector和10× PCR Buffer：宝生物工程（大连）有限公司；引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

2.仪器与设备

HBM-400B拍击式无菌均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；DCodeTM System：美国Bio-Rad公司；VeritiTM 96孔梯度PCR扩增仪：美国AB公司；5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度计：美国Nano Drop公司；Bio-5000 plus扫描仪：上海中晶科技有限公司；Miseq PE300高通量测序平台：美国Illumina公司；R920机架式服务器：美国DELL公司。

3.方 法

（1）样品采集

本研究分别从湖北省恩施市土桥坝和舞阳坝体育场菜市场采集腊肠样品5个，编号为LC1-LC5。

（2）样品预处理微生物宏基因组DNA提取

将腊肠切碎后，取10 g加入90 mL生理盐水，使用拍击器拍击3 min后，300 r/min离心10 min取上清，上清液10 000 r/min离心10 min后取沉淀，参照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit约束方法进行微生物宏基因组DNA提取。(www.xing528.com)

（3）基于DGGE技术的腊肠细菌多样性评价

用灭菌双蒸水将各样品宏基因组DNA的浓度调至30 ng/μL用于后续扩增PCR扩增体系为25 μL，正向和反向引物分别为LacF-GC-V3F（5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGCCT ACGGGAGGCAGCAG-3’）和Lac-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’），扩增条件和程序参照文献12和13中的方法进行。扩增结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳（2 000 bp的Maker为参照，电压为120 V，恒压时间为30 min）检测是否扩增出单一明亮的目的条带。

本研究使用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性范围为35%～52%，将0.5×TAE缓冲溶液温度调至60 °C，每个胶孔加入10 μL扩增产物，120 V预电泳78 min然后80 V固定电压下电泳13 h。电泳结束后的凝胶采用银染法显色，并置于扫描仪上成像[14]。用无菌手术刀回收优势条带，加无菌超纯水过夜，取回溶液2 μL进行PCR扩增，扩增使用不带GC夹子的正反引物各0.5 μL以及12.5 μL 2×PCR mix，用无菌超纯水补齐至20 μL，扩增程序同1.2.3。将重新扩增的PCR产物用清洁试剂盒清洁后连接至PMD18-T载体上，然后导入大肠杆菌Top10，将筛选出的阳性克隆送至测序公司测序。

（4）基于Miseq高通量测序技术的腊肠细菌多样性评价

对样品微生物宏基因组16s rRNA的V3～V4进行扩增，引物为338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’），扩增时在引物的5’端加上核酸标签，扩增体系和条件参照蔡丽云[15]的方法。扩增产物检测合格后寄至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，测序平台为Illumian Miseq PE300。

将测序数据上传至R920机架式服务器端，利用QIIME分析平台[16]进行序列分析。原始数据去除低质量序列后采用两步UCLUST法[17]在97%的相似度下划分分类操作单元（Operational taxonomic units，OTU）；从每个OTU中挑选代表性序列与RDP（Ribosomal Database Project，Release 11.5）[18]和Greengenes（Release 13.8）[17]数据库进行比对后使用FastTree软件[19]构建系统发育进化树，并计算α多样性。

（5）数据处理

使用多元统计学手段对微生物各分类地位的种类、数量、相对含量以及α多样性指数进行计算；序列长度分布图、OTU出现频率和包含序列数统计图以及腊肠中优势核心OTU相对含量的比较分析由Origin2017软件绘制；腊肠中优势细菌门属相对含量的比较分析图和腊肠中优势核心OTU相对含量的比较分析图由Excel 2016绘制。