毛霉分离及其在豆腐乳制作技术中的应用

一、目的要求

1.学习毛霉的分离和纯化方法。

2.熟悉豆腐乳发酵的工艺过程。

3.观察豆腐乳发酵过程中的变化。

二、基本原理

豆腐乳是我国传统的发酵食品，具有品种多样、风味独特、滋味鲜美、营养丰富等特点，是豆腐经过毛霉前期发酵及盐腌后期发酵而制成的。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。毛霉在豆腐坯上生长，洁白的菌丝可以包裹豆腐坯使其不易破碎，同时分泌出一定数量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶系，对豆腐坯中的大分子成分进行初步的降解。发酵后的豆腐毛坯经过加盐腌制后，有大量嗜盐菌、嗜温菌生长，由于这些微生物和毛霉所分泌的各种酶类的共同作用，大豆蛋白逐步水解，生成各种多肽类化合物如降血压肽和抗氧化活性肽，并可进一步生成部分游离氨基酸，大豆脂肪经降解后生成小分子脂肪酸并与添加的酒类中的醇合成各种芳香酯，大分子糖类在淀粉酶的催化下生成低聚糖和单糖，形成细腻、鲜香的豆腐乳特色。

三、材料与仪器

（1）菌种 毛霉斜面菌种。

（2）培养基（料） 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒。

（3）试剂 无菌水、食盐。

（4）仪器和用具培养皿、500mL三角瓶、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。

四、方法与步骤

（一）流程

1.毛霉的分离

配制培养基→毛霉分离→观察菌落→显微镜检。

2.豆腐乳的制备

悬液制备→接种孢子→培养与晾花→装瓶与压坯→装坛发酵→感官鉴定。

（二）操作方法

1.毛霉的分离

（1）配制培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），经配制、灭菌后倒平板备用。

（2）毛霉的分离 从长满毛霉菌丝的豆腐坯上取小块于5mL无菌水中，振摇，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20℃培养1～2d，以获取单菌落。(www.xing528.com)

（3）菌落鉴定

①菌落观察：菌落呈白色棉絮状，菌丝发达。

②显微镜检：于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、孢囊梗的着生情况。若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。

2.豆腐乳的制备

（1）悬液制备

①毛霉菌种的扩大培养：将平板分离得到的毛霉单菌落接入斜面培养基，于25℃培养2d；再将斜面菌种转接到三角瓶种子培养基中，于同样温度下培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。

②孢子悬液制备：于上述三角瓶种子培养基中加入无菌水200mL，用玻璃棒搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒还三角瓶，再加200mL无菌水洗涤1次，合并滤于第一次滤液中，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。

（2）接种孢子 用刀将豆腐坯划成4.1cm×4.1cm×1.6cm的块，将笼格经蒸汽消毒、冷却，将孢子悬液喷洒笼格内壁，然后把划块的豆腐坯均一竖放在笼格内，块与块之间间隔2cm。再用喷枪向豆腐块上喷洒孢子悬液，使每块豆腐周身沾上孢子悬液。

（3）培养与晾花 将放有接种豆腐坯的笼格放入培养箱中，于20℃左右培养，培养20h后，每隔6h上下层调换一次，以更换新鲜空气，并观察毛霉生长情况。培养44～48h后，菌丝顶端已长出孢子囊，腐乳坯上毛霉呈棉花絮状，菌丝下垂，白色菌丝已包围住豆腐坯，此时将笼格取出，使热量和水分散失，坯迅速冷却，其目的是增加酶的作用，并使霉味散发，此操作在工艺上称为晾花。

（4）装瓶与压坯 将冷至20℃以下的坯块上互相依连的菌丝分开，用手指轻轻在每块表面揩涂一遍，使豆腐坯上形成一层皮衣，装入玻璃瓶内，边揩涂边沿瓶壁呈同心圆方式一层一层向内侧放，摆满一层稍用手压平，撒一层食盐，每100块豆腐坯用盐约400g，使平均含盐量约为16%，如此一层层铺满瓶。下层食盐用量少，向上食盐逐层增多，腌制中盐分渗入毛坯，水分析出，为使上下层含盐均匀，腌坯3～4d时需加盐水淹没坯面，称之为压坯。腌坯周期冬季13d，夏季8d。

（5）装坛发酵

①红方：按每100块坯用红曲米32g、面曲28g、甜酒酿1kg的比例配制染坯红曲卤和装瓶红曲卤。先用200g甜酒酿浸泡红米和面曲2d，研磨细，再加200g甜酒酿调匀即为染坯红曲卤。将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，放在染坯红曲卤内，六面染红，装入经预先消毒的玻瓶中。再将剩余的红曲卤用剩余的600g甜酒酿兑稀，灌入瓶内，淹没腐乳，并加适量盐和50度白酒，加盖密封，在常温下贮藏6个月成熟。

②白方：将腌坯沥干，待坯块稍有收缩后，将按甜酒酿0.5kg、黄酒1kg、白酒0.75kg、盐0.25kg的配方配制的汤料注入瓶中，淹没腐乳，加盖密封，在常温下贮藏2～4个月成熟。

（6）质量鉴定：将成熟的腐乳开瓶，进行感官质量鉴定、评价。

五、结果报告

1.从腐乳的表面及断面色泽、组织形态（块形、质地）、滋味及气味、有无杂质等方面综合评价腐乳质量。

2.试分析腌坯时所用食盐含量对腐乳质量有何影响？

六、复习思考题

1.腐乳生产主要采用何种微生物？

2.腐乳生产发酵原理是什么？