一、目的要求
1.学会用涂布法从甜酒曲中分离纯化优良根霉糖化菌株。
2.了解甜酒曲中主要微生物及其在发酵过程中的作用。
二、基本原理
甜酒曲最主要的用途是用于制作甜酒酿，在甜酒酿制作过程中，甜酒曲是主要的发酵制剂。甜酒曲是糖化菌及酵母制剂，其所含的微生物主要有根霉、毛霉及少量酵母。甜酒曲中起主要作用的是根霉，在发酵过程中，根霉能产生糖化型淀粉酶，将糯米中的淀粉分解成葡萄糖，然后少量的酵母又将葡糖糖经糖酵解途径转化成酒精，这样就制成了香甜可口、营养丰富的甜酒酿。根霉在糖化过程中还产生少量的有机酸，如乳酸、琥珀酸、延胡索酸等，降低基质pH而抑制杂菌生长。
本实验采用平板划线（或涂布）法从甜酒曲中分离纯化优良的根霉糖化菌株，为纯种制备甜酒曲提供优良的生产菌种。根霉菌株的分离采用透明圈法，即先用含淀粉的琼脂培养基培养根霉菌株，由于根霉菌株分泌糖化淀粉酶，使菌落周围的淀粉被水解，遇碘后呈无色透明圈，而平板的其他处呈蓝色。透明圈越大，表明该根霉菌株的糖化力越高，因此，可通过透明圈的大小筛选出糖化力高的菌株。
三、材料与仪器
（1）菌种 甜酒曲。
（2）培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。
（3）染色液和试剂无菌生理盐水（9mL/试管；10mL/100mL三角瓶，内带玻璃珠）、乳酸石炭酸棉蓝染色液、碘液。
（4）仪器和用具 普通光学显微镜、无菌培养皿、1mL无菌吸管、无菌试管、无菌涂布棒、无菌纱布、镊子、研钵、接种环、载玻片、盖玻片等。
四、方法与步骤
1.制平板培养基
将融化并冷却至50℃左右的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）倒入无菌培养皿内，每皿约15mL，待凝固，制成平板培养基。
2.制备孢子悬液(www.xing528.com)
取甜酒曲少许，先在研钵中磨细，再加入10mL无菌生理盐水的三角瓶（带玻璃珠）中，用力振荡打散孢子团粒，使之形成均匀的孢子悬浮液，然后将其用无菌纱布过滤到无菌试管中。
3.稀释涂布平板培养
将上述孢子悬浮液以10倍稀释法稀释到一定浓度，取其中2～3个适当稀释度的孢子悬液各0.2mL，加到上述平板培养基上，再用无菌涂布棒涂布均匀，倒置于28～30℃恒温箱中培养2d后观察形态特征。
4.观察形态特征
（1）菌落特征 根霉为扩散性生长的菌落，菌落蜘蛛网状，菌丝发达为白色，孢子黑色。
（2）个体形态 取一块载玻片，在其上加1滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，取少许菌丝涂于染液中，盖上盖玻片，镜检，观察根霉的假根、孢子囊、孢囊孢子等形态特征。
5.纯培养
当菌落刚形成而孢囊孢子未生成时，在菌落周围滴加碘液数滴，测量菌落周围出现的透明圈的直径。最后选择分离效果好、透明圈较大的根霉单菌落接种于新鲜马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面上，于28～30℃培养2～3d。
五、结果报告
1.描述你所分离的根霉菌落形态特征，并绘出其个体形态图。
2.列表比较分离到的各根霉菌落用碘液初步鉴定的透明圈大小。
六、复习思考题
1.透明圈直径大小与菌株糖化型淀粉酶产量有何关系？
2.设计一个从甜酒曲中分离纯化啤酒酵母的简明实验方案。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
