食品安全实验：大肠菌群检测实验

一、目的要求

（1）学习食品中大肠菌群的检测程序和方法。

（2）掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。

二、基本原理

大肠菌群指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖，产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。

三、实验材料

器材、培养基及试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤发酵管、煌绿乳糖胆盐肉汤发酵管、磷酸盐缓冲液；无菌生理盐水、恒温培养箱、恒温水浴箱、天平、均质器、锥形瓶、吸管等。

四、实验步骤

（一）大肠菌群MPN计数的检验程序

大肠菌群MPN计数的检验程序见图12-19。

图12-19 大肠菌群MPN计数检验程序

（二）操作步骤

1.样品的稀释

（1）称取固体和半固体检样25g置放于含有225mL生理盐水或磷酸盐缓冲溶液的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，制成1∶10样品匀液。如果是液体样品，以无菌吸管吸取25mL样品置放于含有225mL生理盐水或磷酸盐缓冲溶液的无菌锥形瓶中（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠），充分混匀，制成1∶10样品匀液。

（2）样品匀液的pH应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。

（3）用1mL无菌吸管吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

（4）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。(www.xing528.com)

2.初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如果接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），（36±1）℃培养（24±2）h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至（48±2）h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠杆菌阴性，产气者进行复发酵试验。

3.复发酵试验

用接种环从所有（48±2）h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，（36±1）℃培养（48±2）h，观察产气情况。产气者，计为大肠杆菌阳性管。

4.大肠杆菌最可能数（MPN）的报告

根据大肠杆菌阳性管数，检索MPN表（见表12-2），报告每1g（或1mL）样品中大肠菌群的MPN值。

表12-2 每1g（或1mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索表

续表

注（1）本表采用3个稀释度［0.1g（或0.1mL）、0.01g（或0.01mL）和0.001g（或0.001mL）］，每个稀释度接种3管。

（2）表内所列检样量如改用1g（或mL）、0.1g（或0.1mL）和0.01g（或0.01mL）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（或0.01mL）、0.001g（或0.001mL）和0.0001g（或0.0001mL）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。

五、实验报告

阐述大肠菌群MPN计数检测过程，详细记录检测数据并正确报告检测结果。

六、思考题

（1）从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min，为什么？

（2）大肠菌群MPN计数检测过程注意事项有哪些？