一、目的要求
（1）学习活菌计数的方法。
（2）掌握食品中菌落总数测定结果的报告方式。
二、基本原理
食品中细菌污染的程度，反映了食品的一般卫生质量，以及食品在产、贮、运、销过程中的卫生措施及管理情况。食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或1g）检样中形成菌落的总数，称为菌落总数。
三、实验材料
器材、培养基及试剂：平板计数琼脂、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水；恒温培养箱、恒温水浴箱、天平、均质器、吸管、培养皿、锥形瓶等。
四、实验步骤
（一）菌落总数的检验程序
菌落总数的检验程序见图12-18。
图12-18 菌落总数的检验程序
（二）操作步骤1.样品的稀释
（1）称取固体和半固体检样25g置放于含有225mL生理盐水或磷酸盐缓冲溶液的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，制成1∶10样品匀液。如果是液体样品，以无菌吸管吸取24mL样品置放于含有225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶中（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠），充分混匀，制成1∶10样品匀液。
（2）用1mL无菌吸管吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。
（3）按照上述程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管。
（4）根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别取1mL样品匀液加入两个无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加入两个无菌平皿做空白对照。
（5）及时将15～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基［可放置于（46±1）℃恒温水浴箱中保温］倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2.培养
琼脂凝固后，将平板翻转，（36±1）℃培养（48±2）h。水产品（30±1）℃培养（72±3）h。
3.菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony—forming units，CFU）表示。
（1）选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而另一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2来代表一个平板菌落数。
（3）当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
4.结果表述
（1）菌落总数的计算方法(www.xing528.com)
①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每1g（或1mL）中菌落总数结果。
②若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，计算公式如下所示。
N＝∑C/（n1+0.1n2）d
式中 N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一个适宜稀释度平板上的菌落数；
n2——第二个适宜稀释度平板上的菌落数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
例如：
上述数据经四舍五入后，表示为25000或2.5×104。
③若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
④若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
⑤若所有稀释度（包括液体样品原液）均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
⑥若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均数乘以稀释倍数计算。
（2）菌落总数的报告
①菌落数在100以内时，按四舍五入原则修约，采用两位有效数字报告。
②大于或等于100时，第三位数字采用四舍五入原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。
③若所有平板上为蔓延菌落而无法计数时，则报告菌落蔓延。
④若空白对照上有菌落生长，则此检测结果无效。
⑤称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
五、实验报告
阐述菌落总数检测过程，详细记录检测数据并正确计算和报告检测结果。
六、思考题
菌落总数的检测过程中应该注意哪些问题？
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