高效保藏十三种微生物菌株的实验技术

一、目的要求

（1）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。

（2）学习斜面传代保藏技术。

（3）学习液体石蜡保藏技术。

（4）学习沙土管保藏技术。

（5）学习冷冻干燥保藏技术。

二、实验材料

（1）菌种 细菌、酵母菌、放线菌和霉菌斜面菌。

（2）器材、培养基及试剂 牛肉膏蛋白胨培养基斜面（培养细菌）、麦芽汁培养基斜面（培养酵母菌）、高氏Ⅰ号培养基斜面（培养放线菌）、马铃薯蔗糖培养基斜面（培养丝状真菌）；无菌水、液体石蜡、P₂O₅、脱脂乳粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、河沙、瘦黄土（有机物含量少的黄土）；无菌试管、无菌吸管（1mL及5mL）、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、三角烧瓶（250mL）。

三、操作步骤

下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做。

（一）斜面传代保藏法

（1）贴标签 取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。

（2）斜面接种 将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子。

（3）培养 细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。

（4）保藏 斜面长好后，可直接放入4℃冰箱中保藏，为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。

保藏时间依微生物种类而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存2～6个月移种一次，而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。此法的缺点是容易变异，污染杂菌的机会较多。

（二）液体石蜡保藏法

（1）液体石蜡灭菌在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃湿热灭菌30min，然后于40℃温箱中放置l4d（或置于105～110℃烘箱中1h），以除去石蜡中的水分，备用。

（2）接种培养 同斜面传代保藏法。

（3）加液体石蜡 用无菌滴管吸取液体石蜡，以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。

（4）保藏 棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存，利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。

（5）恢复培养 用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基中培养。由于菌体表面粘有液体石蜡，生长较慢且有黏性，故一般需转接2次才能获得良好菌种。

（三）沙土管保藏法

（1）沙土处理

①沙处理：取河沙经40目过筛，去除大颗粒，加10%HCl浸泡（用量以浸没沙面为宜）2～4h（或煮沸30min），以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。

②土处理：取非耕作层瘦黄土（不含有机质），加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目过筛，去除粗颗粒后备用。

（2）装沙土管 将沙与土按2∶1、3∶1或4∶1（质量比）比例混合均匀装入试管中（10mm×100mm），装置约7cm高，加棉塞，并外包牛皮纸，121℃湿热灭菌30min，然后烘干。

（3）无菌试验 每10支沙土管任抽一支，取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适的温度下培养2～4d，确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌，经重新灭菌后再做无菌试验，直到合格。

（4）制备菌液 用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。(www.xing528.com)

（5）加样 用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1～0.5mL加入沙土管中，用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。

（6）干燥 将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P₂O₅作为干燥剂，可再用真空泵连续抽气3～4h加速干燥，将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。

（7）保藏 沙土管可选择下列方法之一来保藏：

①保存于干燥器中；

②用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；

③将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；

④将沙土管装入有CaCl₂等干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封口，放入冰箱中或室温下保存。

（8）恢复培养 使用时挑取少量混有孢子的沙土，接种于斜面培养基上或液体培养基内培养即可，原沙土管仍可继续保藏。此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，可保存2年左右，但不能用于保藏营养细胞。

（四）冷冻干燥保藏法

（1）准备安瓿管 选用内径5mm、长10.5cm的硬质玻璃试管，用10%HCl浸泡8～10h后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1～2次，烘干，将印有菌名和接种日期的标签放入安瓿管内，有字的一面朝向管壁。管口加棉塞121℃灭菌30min。

（2）制备脱脂牛乳 将脱脂乳粉配成20%的乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并做无菌试验。

（3）准备菌种 选用无污染的纯菌种，培养时间一般细菌为24～48h，酵母菌为3d，放线菌与丝状真菌7～10d。

（4）制备菌液及分装 吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动菌落，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。

（5）预冻 将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15mm处，再通过乳胶管把安瓿管连接于总管的侧管上，总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接，并将所有安瓿管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中（此时槽内温度可达—50～—40℃），只需冷冻1h左右，即可使悬液冻结成固体。

（6）真空干燥 完成预冻后，升高总管使安瓿管仅底部与冰面接触（此处温度约—10℃），以保持安瓿管内的悬液仍呈固体状态。开启真空泵后，应在5～15min内使真空度达66.7Pa以下，使被冻结的悬液开始升华，当真空度达到26.7～13.3Pa时，冻结样品逐渐被干燥成白色片状，此时使安瓿管脱离冰浴，在室温下（25～30℃）继续干燥（管内温度不超过30℃），升温可加速样品中残余水分的蒸发。总干燥时间应根据安瓿管的数量、悬浮液装量及保持剂性质来定，一般3～4h即可。

（7）封口样品 干燥后继续抽真空达1.33Pa时，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧，拉成细颈并熔封，然后置4℃冰箱内保藏。

（8）恢复培养 用75%乙醇消毒安瓿管外壁后，在火焰上烧热安瓿管上部，然后将无菌水滴在烧热处，使管壁出现裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中缓慢进入管内后，将裂口端敲断，再用无菌的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中，放置在最适温度下培养。冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保藏方法之一，保存时间可长达10年以上。

四、注意事项

（1）从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后，接种环上带有油和菌，故接种环在火焰上灭菌时要先在火焰边烤干再直接灼烧，以免菌液四溅引起污染。

（2）在真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状态，以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。

（3）熔封安瓿管时注意火焰大小要适中，封口处灼烧要均匀，若火焰过大，封口处易弯斜，冷却后易出现裂缝而造成漏气。

五、实验报告

（1）按表12-1记录菌种保藏方法和结果。

表12-1 菌种保藏方法和结果

（2）试述各种菌种保藏方法的优、缺点。

六、思考题

（1）如何防止菌种管棉塞受潮和杂菌污染？

（2）冷冻干燥装置包括哪几个部件？各个部件起什么作用？

（3）现有一个纤维素酶的高产霉菌菌株，你选用什么方法保存？试设计一个实验方案。