微生物分离纯化与接种技术实验实训

一、目的要求

（1）学习用无菌操作技术从土壤中分离微生物的方法。

（2）学习用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。

（3）学习用平板划线方法分离微生物。

（4）学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。

二、实验材料

（1）菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus au-reus）。

（2）器材、培养基及试剂 淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基）、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基、查氏琼脂培养基、半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基；10%酚液、链霉素、盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、土样、酒精灯、玻璃铅笔、火柴、试管架、接种针、滴管。

三、操作步骤

（一）土壤稀释分离和纯化

1.稀释涂布平板法

（1）倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热熔化，待冷却至55～60℃时，高氏Ⅰ号琼脂培养基中加入10%酚液数滴，马丁氏培养基中加入链霉素溶液（终浓度为30μg/mL），混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

（2）制备土壤稀释液 称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL，加入另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6不同稀释度的土壤溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。

（3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10^-4、10^-5和10^-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10^-4、10^-5、10^-6三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2mL，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。

用右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～10min，使菌液浸入培养基。

（4）培养 将高氏Ⅰ号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。

（5）挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

2.平板划线分离法

（1）倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。

（2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10^-1的土壤悬液一环在平板上划线（见图12-16）。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列两种（见图12-17）。

图12-16 平板划线操作

图12-17 划线分离图

连续划线分离法：先将一环土壤悬液在琼脂平板上处轻轻涂抹，然后再用接种环在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面［图12-17（1）］。此法常用于含菌量不多的标本。

分区划线分离法：用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分做第三次划线和通过第三次平行划线部分做第四次平行划线［见图12-17（2）］。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室中培养。此法适用于杂菌量较多的标本。(www.xing528.com)

（3）挑菌落 同稀释涂布平板法，一直到认为分离的微生物纯化为止。

（二）斜面接种和穿刺接种

1.斜面接种法

（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。

（2）接种的方法是，用接种环蘸取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把培养基划破。

（3）接种后30℃ 恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。

2.穿刺接种法

（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等）。

（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意勿使接种针在培养基内左右移动，以保持穿刺线整齐，便于观察生长结果。

四、注意事项

（1）一般土壤中细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。

（2）在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。

五、实验报告

（1）记录土壤稀释分离结果，并计算出每1g土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。

计算方法：选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数，计算公式如下。

总菌数/g＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数×5

（最后吸取0.2mL）［或×10（最后吸取0.1mL）］

（2）分别记录平板划线、斜面接种的结果，并自我评价。

（3）比较两种细菌穿刺接种的结果，并进行分析。

六、思考题

（1）如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。

（2）为什么高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚液和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？

（3）试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌并进行计数。