一、目的要求
（1）了解培养基配制的原理，掌握常用培养基的制备过程及方法。
（2）了解灭菌的基本原理，掌握干热灭菌、高压蒸汽灭菌技术。
二、基本原理
经人工配制适合微生物生长发育的营养基质称为培养基。良好的培养基应具备合理比例的各种营养物质，适宜的pH和一定的缓冲能力，一定的氧化还原电位和合适的渗透压。培养基按照成分分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基。培养基可做成液体、固体和半固体的，在液体培养基中加入琼脂等凝固剂，可制得固体与半固体培养基，其加入量一般分别为15～20g/L和3～20g/L。琼脂一般不能被微生物分解利用。
在微生物实验、生产和研究方面，需要进行微生物的纯培养，不能有任何的杂菌。因此，对所使用的培养皿、培养基等材料需要进行严格的灭菌。灭菌就是应用物理或化学的方法杀死物品上或环境中的所有微生物。最常用的灭菌方法有干热灭菌法和湿热灭菌法。
干热灭菌法有火焰灭菌法和干烤灭菌法。火焰灭菌法是直接利用火焰把微生物灼烧杀死的常用方法，适用于接种环、接种针等金属用具。在接种过程中，试管或三角瓶口也采用火焰达到灭菌目的。干烤灭菌是利用电热烘烤箱内的干热空气进行灭菌，一般需要加热到160～170℃，维持1～2h，它适合于能耐高温的物品，比如吸管、培养皿、金属工具等。
湿热灭菌法是利用煮沸或饱和水蒸气杀死微生物的灭菌方法。常用的湿热灭菌法有高压蒸汽灭菌和间歇灭菌。间歇灭菌是对一些不适合高压蒸汽灭菌的物品的灭菌方法，通常操作是先100℃，维持30min，然后将物品取出并室温放置12～18h，此时难以杀死的细菌芽孢将萌发形成营养体，再次进行100℃、30min的灭菌，从而达到彻底灭菌的目的。高压蒸汽灭菌是灭菌技术中应用最广、效果最好的湿热灭菌法，它是通过提高灭菌锅内的压力来提高水的沸点和蒸汽的温度达到灭菌的目的。由于菌体蛋白的变性凝固的温度与其含水量有关，含水量越高，凝固温度越低，所以湿热灭菌的温度和灭菌时间都低于干热灭菌。通常高压蒸汽灭菌压力为0.1MPa，时间25～30min，此时温度121.5℃，它主要适用于培养皿、培养基、工作服等的灭菌。在使用高压蒸汽灭菌锅时，灭菌锅内空气是否完全排除极为重要。
三、实验材料
器材与试剂 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、1mol/L NaOH等；天平、电炉、高压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、精密pH试纸（5.5～9.0）、试管、三角瓶、烧杯、漏斗、玻璃棒等。
四、实验步骤
（一）液体培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）的制备
（1）按照培养基配方（见表5-13），称量药品、试剂。
（2）在小铝锅中加入所需水量，在锅内壁上贴湿纸条一个，使纸条下端与液面相接，即为液面高度的标记，在电炉上加热。
（3）往锅内加入称量好的药品与试剂，并溶解完全，同时补足因蒸发而失去的水分。
（4）用玻璃棒蘸取培养基少许，以pH试纸测定酸碱度，使用1mol/L NaOH调pH至7.0～7.2。
（5）趁热用漏斗分装于15mm×150mm试管中（见图12-15），每管4～5mL，剩余培养基装入三角瓶中。
（6）分装完毕后，塞上棉塞，用牛皮纸包扎。注明培养基名称、时间等信息，然后立即进行高压蒸汽灭菌。棉塞的作用是一方面阻止外界微生物进入培养基内，另一方面保证有良好的通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。
（二）固体培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）的制备
（1）在小铝锅中加入所需水量，在锅内壁上贴湿纸条一个，使纸条下端与液面相接，即为液面高度的标记，在电炉上加热。(www.xing528.com)
（2）按照配方（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.0～7.2）称取琼脂，放入锅内煮沸，用玻璃棒不断搅拌以免煳底烧焦，并防止溢出锅外，加热至琼脂完全溶化。
图12-15 培养基分装
1—正确 2—管内太短，外部太松 3—整个棉塞太松
4—管内太紧，外部太短松
（3）加入配方中的其他药品和试剂，使其完全溶解，同时补足因蒸发而失去的水分。
（4）调节pH，趁热分装于试管和三角瓶中，塞棉塞并包扎。在操作中，速度要快，以免培养基凝固；同时勿使培养基沾污瓶口、试管口、棉塞，以免造成污染。
（三）高压蒸汽灭菌
（1）往灭菌锅内加入适量的水，然后把要灭菌的物品放入，盖上锅盖，拧紧螺栓。
（2）调节压力和时间控制旋钮，调整至合适参数（通常为0.1MPa、30min）。
（3）打开电源开关进行加热，当压力表上升到0.05MPa时，打开放气阀，排尽空气后关闭，并继续加热。
（4）当压力表上升到0.1MPa时，灭菌锅自动开始计时，维持30min后，灭菌锅自动停止加热。如果灭菌锅没有自动计时功能，就需要灭菌人员在压力达到要求后开始计时，时间结束后，关闭电源。
（5）待压力表降至零时，方可打开锅盖，取出灭菌物品。如需进行摆放斜面或倒平板，应趁热将试管倾斜摆成斜面或待培养基冷却至50～60℃进行倒平板。
（6）将灭菌后的培养基置于37℃恒温箱中培养2～3d，如无菌生长，证明灭菌合格。
五、实验报告
总结配制培养基的全部工作过程。
六、思考题
（1）为什么干热灭菌比湿热灭菌要求温度高、时间长？
（2）在高压蒸汽灭菌时，为什么排尽空气至关重要？
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