酵母菌死活细胞的鉴别和计数方法优化

一、目的要求

（1）掌握鉴别酵母菌死、活细胞的染色技能。

（2）了解血球计数板的构造、原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。

二、基本原理

酵母菌活细胞的还原力较强，使用美蓝染液染色后，美蓝又被还原为无色，而死细胞则染上蓝色。因此，通过美蓝染液染色可以鉴别酵母细胞的死活情况。

利用血球计数板镜检计数是一种常用的方法，一般适合含菌体较大的单细胞菌悬液，如酵母菌、霉菌孢子等。血球计数板（见图12-14）为一特制的厚形载玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间的较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室。一个计数室的长和宽均为1mm，加盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的距离为0.1mm，所以，计数室的体积为0.1mm³。另外，一个计数室各边分为20等分，因此一个大方格等分为400个小方格。

图12-14 血球计数板

计数时，首先把稀释n倍后的菌悬液（适当浓度）注入计数室，然后在显微镜下计数。为减少误差，通常每个视野任意计数5个小方格内的细胞总数，并观察5个视野，并求每个视野内的平均值（A）。位于小方格四边的压线细胞，只计两边，另两边不计；对于出芽的酵母，以芽体与细胞接近大小时，按2个菌体计数。然后求出每1mL菌悬液中的细胞个数（N），具体计算公式如下。

N＝8×10⁵×A×n

三、实验材料

（1）菌种 酵母菌悬液。

（2）器材及试剂 0.1%美蓝染液、血球计数板、盖玻片、无菌滴管、吸水纸、擦镜纸、显微镜等。

四、实验步骤(www.xing528.com)

（一）酵母菌死活细胞的鉴别

取0.1%美蓝染液一滴于载玻片中央处，再滴加一滴酵母菌悬液并混匀，染色3～5min，加盖玻片进行镜检。未被染色的为活细胞，被染成蓝色的为死细胞。

（二）酵母菌血球计数板镜检计数

（1）取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。

（2）用无菌滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细管作用渗入计数室，注意不能有气泡产生，然后放置于载物台上，静置数分钟，使菌细胞沉积于平面上。

（3）使用高倍镜进行镜检，每个视野任意计数5个小方格内的细胞总数，观察5个视野。

（4）测数完毕后，取下盖玻片，用清水把血球计数板冲洗干净，用吸水纸轻轻吸去残留水分。注意勿使网格受到磨损，放入盒内保存。

五、实验报告

计算并报告所测样品每毫升的细胞数。

六、思考题

血球计数板的结构和镜检计数的原理是什么？