一、目的要求
1.了解荚膜染色的原理。
2.掌握荚膜染色的方法。
二、基本原理
荚膜是包绕在细菌细胞壁外的一层黏液性物质，其化学成分为多糖、多肽或糖蛋白。由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法，使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜含水量在90%以上，所以染色时一般不通过加热固定，以免荚膜皱缩变形。
三、材料与仪器
（1）菌种 胶质芽孢杆菌斜面培养物（培养3～5d），该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，产生丰厚的荚膜。
（2）染色液和试剂 石炭酸复红染色液、黑素溶液、6%葡萄糖水溶液、甲醇、1%甲基紫水溶液、用滤纸过滤后的墨水、香柏油、二甲苯、蒸馏水。
（3）仪器和用具 普通光学显微镜、接种环、酒精灯、火柴、载玻片、盖玻片、滤纸等。
四、方法与步骤
（一）负染色法
1.制片
取洁净的载玻片1块，加1滴蒸馏水，用接种环按无菌操作方法从斜面培养物上挑取少许菌种，在水滴中涂成均匀的薄膜，涂抹直径约为1cm。
2.干燥
将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
3.染色
将石炭酸复红染色液1～2滴加在涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色2～3min。
4.水洗
倾去染液，斜置玻片，用细小的水流从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂面薄膜脱落。
5.干燥
将染色片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
6.涂黑素
在染色涂面左边加1小滴黑素溶液，取一块边缘光滑的载玻片，让载玻片的边缘轻轻接触黑素溶液左边，使黑素溶液沿玻片接触处散开，然后向右一拖，使黑素溶液在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。注意：此操作的关键是涂抹黑素要薄。
7.镜检
先用低倍物镜找到物像，再用高倍物镜观察。
结果：背景灰色，菌体红色，荚膜无色透明。
（二）湿墨水法
1.制菌液
在一洁净的载玻片上加1滴墨水，用接种环挑取少量菌体与这滴墨水混合均匀。
2.加盖玻片
用镊子夹一洁净无油污的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，避免产生气泡，否则影响观察结果。然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。(www.xing528.com)
3.镜检
先用低倍物镜找到物像，再用高倍物镜观察。
结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
（三）干墨水法
1.制菌液
取1滴6%葡萄糖水溶液于洁净载玻片的一端，用接种环挑取少量菌体与其充分混合，再加入1滴墨水充分混匀。
2.制片
取一块边缘光滑的载玻片，让载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30°角迅速而均匀地将菌液拉向玻片的另一端，将菌液铺成一薄膜（图12-13）。
图12-13 荚膜干墨水染色的涂片方法
（刘慧.现代食品微生物学实验技术.2006）
3.干燥
将涂片放在空气中自然干燥。
4.固定
在涂面上滴加甲醇，以浸没涂面为宜，固定1min，然后立即倾去甲醇。
5.干燥
将涂片放在酒精灯上方（火焰较高处）用文火干燥，勿使玻片发热。
6.染色
将1%甲基紫水溶液1～2滴加在涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色1～2min。
7.水洗
倾去染液，斜置玻片，用细小的水流从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂面薄膜脱落。
8.干燥
将涂片放在空气中自然干燥。
9.镜检
先用低倍物镜找到物像，再用高倍物镜观察。
结果：背景灰色，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈即为荚膜。
五、结果报告
绘出你所观察到的胶质芽孢杆菌的形态图，并注明各部分的名称。
六、复习思考题
1.荚膜染色为什么要用负染色法？
2.干墨水法与湿墨水法有何区别？
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