细菌鞭毛染色技术实验实训六

一、目的要求

1.了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法。

2.观察细菌鞭毛的形态特征。

3.学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。

二、基本原理

鞭毛是细菌的运动器官。细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的重要特征。细菌的鞭毛极细，直径一般为10～20nm，除了很少数能形成鞭毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用普通光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜才能观察到。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用特殊的染色法，即鞭毛染色法。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让媒染剂沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。

采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否具有鞭毛。此法较快速、简便。

悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，然后放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，放置在普通光学显微镜下观察。

大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的种类有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。

三、材料与仪器

（1）菌种 将保存的枯草杆菌在新制备的普通牛肉膏蛋白胨斜面培养基上连续移种2～3次，每次将菌种培养7～16h，菌种活化后备用。

（2）染色液和试剂 镀银法鞭毛染色液（A液、B液）、0.01%的美蓝水溶液、凡士林、香柏油、二甲苯、蒸馏水、无菌水。

（3）仪器和用具 普通光学显微镜、接种环、酒精灯、火柴、载玻片、盖玻片、凹玻片、镊子、记号笔、吸水纸、擦镜纸等。

四、方法与步骤

（一）细菌鞭毛染色

1.制片

取高度洁净、无油渍、无划痕的载玻片，在其一端加1滴蒸馏水，用接种环从活化菌种中取少许菌苔（注意不要带培养基），在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，以使水滴摊薄，用吸水纸吸去多余的菌液，然后平放载玻片。

2.干燥

将涂片放在空气中自然干燥。

3.镀银法染色

（1）滴加鞭毛染色液A液，染色3～5min。

（2）用蒸馏水充分洗净A液，使背景清洁。

（3）将残水沥干或用B液冲去残水。

（4）滴加鞭毛染色液B液，在酒精灯火焰上用微火加热至微冒蒸汽，约维持0.5～1min，加热时应随时补充蒸发掉的染液，不可使玻片出现干涸区。待冷却后，用蒸馏水轻轻冲洗干净，自然干燥。

4.镜检

先用低倍物镜找到物像，再用油镜观察。注意观察鞭毛着生位置，镜检时多找几个视野观察，因为有时只在部分涂片上染出鞭毛。

结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。

5.注意事项

（1）镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放。

（2）细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。(www.xing528.com)

（3）染色用的玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。

（4）染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景不清晰。

（二）细菌的运动性观察

1.水封片法

（1）制备菌液 从幼龄枯草杆菌斜面上，挑取数环菌放入装有1～2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。

（2）滴加菌液 取1块洁净无油污的载玻片，取2～3环稀释菌液于载玻片中央，再滴加1环0.01%的美蓝水溶液，混匀。

（3）加盖玻片 用镊子夹1洁净无油污的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，避免产生气泡（图12-11）。

图12-11 加盖玻片方法

（黄秀梨.微生物学实验指导.1999；钱爱东.食品微生物学（第二版）.2008）

（4）镜检 将显微镜光线适当调暗，先用低倍物镜找到观察部位，再用高倍物镜观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌有明显位移，而后者仅在原处左右摆动。

2.悬滴法

（1）制备菌液 在幼龄枯草杆菌斜面上，加入3～4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。

（2）涂凡士林 取洁净无油污的盖玻片1块，在其四周涂少许凡士林。

（3）滴加菌液 在盖玻片中央滴1小滴菌液，并用记号笔在菌液的边缘做画一记号圈，以便在用显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。

（4）盖凹玻片 将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液，轻轻地盖在盖玻片上，使凹玻片与盖玻片粘在一起（注意菌液不得与凹玻片接触）。然后小心地翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹窝的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片四周使其封闭，以防菌液干燥。

（5）镜检 先用低倍物镜找到记号圈，再稍微移动凹玻片即可找到菌液的边缘，然后将菌液移到视野中央，再换高倍物镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差。如图12-12所示。

图12-12 悬滴标本的制备

（周德庆.微生物学实验教程.2006；黄秀梨.微生物学实验指导.1999）

3.注意事项

（1）检查细菌运动性所用的载玻片和盖玻片都要洁净无油污，否则会影响细菌的运动。

（2）制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。

（3）若使用油镜观察，应在盖玻片上滴加香柏油。

（4）有些细菌，温度太低时不能运动。

五、结果报告

1.绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况，并用箭头表示其运动方向。

2.描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的。

六、复习思考题

1.鞭毛染色需要注意什么问题？为什么要求玻片干净无油污？

2.如何盖好盖玻片？