一、目的要求
1.了解革兰氏染色原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
2.掌握革兰氏染色技术。
二、基本原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家格拉姆（C.Gram）创立的。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。通过革兰氏染色，可将所有细菌区分为两大类，即革兰氏阳性细菌（用G+表示）和革兰氏阴性细菌（用G-表示）。
革兰氏染色法之所以能将细菌区分为G+菌和G-菌，是由于这两类细菌细胞壁的结构和化学组成不同所决定的。当细菌用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成结晶紫—碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用95%乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，G+菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，其形成的网状结构致密，壁厚，脂类物质含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫—碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经复染后仍保留初染剂的蓝紫色；G-菌的细胞壁肽聚糖含量低且结构疏松，而脂类物质含量高，当用乙醇脱色处理时，脂类物质被乙醇溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫—碘复合物被洗脱出来（此时细胞暂时无色），再用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、材料与仪器
（1）菌种 培养24h的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的斜面培养物。
（2）染色液和试剂 草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、0.5%番红染色液、95%乙醇、香柏油、二甲苯。
（3）仪器和用具 普通光学显微镜、接种环、酒精灯、火柴、载玻片、擦镜纸等。
四、方法与步骤
1.制作涂片标本
涂片、干燥、固定方法同细菌的简单染色。
2.初染
将草酸铵结晶紫染液1～2滴加到涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色1min。
3.水洗
倾去染液，斜置玻片，用细小的水流从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂面薄膜脱落。
4.媒染
用路哥氏碘液冲去残水，再将路哥氏碘液1～2滴加到涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色1min。
5.水洗(www.xing528.com)
倾去染液，斜置玻片，用细小的水流从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。
6.脱色
倾斜玻片，连续滴加95%乙醇冲洗脱色，直至流出的乙醇无明显的紫色（一般20～30s）。乙醇的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中关键的一步，脱色不足，阴性菌会被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌会被误染成阴性菌。
7.水洗
倾斜玻片，用细小的水流从载玻片上端缓缓流下。
8.复染
将番红染色液1～2滴加到涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色1～2min。
9.水洗
倾去染液，斜置玻片，用细小的水流从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。
10.干燥
甩去玻片上的水珠后自然晾干；或用吸水纸轻轻吸去水分（不可摩擦）；或在酒精灯火焰高处微火烤干。涂片必须充分干燥。
11.镜检
先用低倍物镜找到物像，再用高倍物镜找到适当视野，将高倍物镜转出，在涂面上加1滴香柏油，最后用油镜观察。
结果：金黄色葡萄球菌呈紫色，大肠杆菌呈红色。
五、结果报告
绘出你所观察到的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明革兰氏染色反应类型。
六、复习思考题
1.革兰氏染色操作过程中应注意哪些问题？哪些环节会影响染色结果的正确性？其中最关键的步骤是什么？
2.乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
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