细菌简单染色技术实验实训

一、目的要求

1.掌握细菌的简单染色技术。

2.学习无菌操作技术。

3.初步认识细菌的形态。

二、基本原理

细菌个体小，比较透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对其进行染色，染色的目的是使细菌细胞吸附染料而带有颜色，使菌体与背景形成明显的色差，易于观察菌体形态。

细菌的简单染色法，就是用一种染料对细菌进行染色的一种方法。用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料。碱性染料电离后，染料带正电荷；酸性染料电离后，染料带负电荷；中性染料电离后，染料兼带正、负电荷。细菌蛋白质等电点较低，在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以，常用碱性染料使其着色。常用的碱性染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红、番红、孔雀绿等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，则应用酸性染料使其着色。常用的酸性染料有：伊红、酸性复红、刚果红等。

三、材料与仪器

（1）菌种培养24h的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌及培养12～18h的枯草杆菌的斜面培养物。

（2）染色液和试剂 草酸铵结晶紫染色液、香柏油、二甲苯。

（3）仪器和用具 普通光学显微镜、接种环、酒精灯、火柴、载玻片、擦镜纸等。

四、方法与步骤

1.涂片

取一块载玻片，在载玻片中央滴1小滴无菌水，用接种环按无菌操作方法从斜面培养物上挑取少许菌种，在水滴中涂成均匀的薄膜，涂抹直径约为1cm（图12-7）。注意将接种环在火焰上彻底灭菌（图12-8）。

2.干燥

将涂片放在室温下自然干燥，也可将涂面朝上在酒精灯火焰高处微火烤干。

3.固定

让涂面朝上，将涂片在酒精灯火焰中以钟摆的速度来回移动3～4次，涂片温度以手背触及涂片背面微烫手为宜（不超过60℃），温度过高易破坏细胞形态。

固定的目的：杀死细菌，固定细胞结构；将细菌固定在载玻片上，以免冲洗时被冲掉；使菌体蛋白质变性，增大细胞的通透性，容易着色。

4.染色

将草酸铵结晶紫染液1～2滴加到涂面上，以染液刚好覆盖涂面为宜，染色0.5～1min。

5.水洗(www.xing528.com)

倾去染液，斜置玻片，用细小的水流从载玻片上端缓缓流下，直至流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂面薄膜脱落（图12-9）。

图12-7 无菌操作取菌过程

1—灼烧接种环 2—拔去棉塞 3—烘烤试管口 4—挑取少量菌体

5—烘烤试管口 6—将棉塞塞好 7—做涂片 8—烧去残留菌体

（刘慧.现代食品微生物学实验技术.2006）

6.干燥

甩去玻片上的水珠后自然晾干；或用吸水纸轻轻吸去水分（不可摩擦）（图12-10）；或在酒精灯火焰高处微火烤干。涂片必须充分干燥。

7.镜检

先用低倍物镜找到物像，再用高倍物镜找到适当视野，将高倍物镜转出，在涂面上加1滴香柏油，最后用油镜观察。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌都呈紫色。

图12-8 接种环在火焰上灭菌方法

图12-9 水洗涂片

（诸葛健，李华钟.微生物学（第二版）.2009）

图12-10 干燥涂片

（诸葛健，李华钟.微生物学（第二版）.2009）

五、结果报告

绘出你所观察到的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌的形态图，并注明菌体名称和放大倍数。

六、复习思考题

1.为什么要进行火焰固定？

2.为什么要求涂片充分干燥后才能用油镜观察？

3.细菌简单染色制片应该注意什么问题？

4.通过镜检，你能正确描述金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌的个体形态及其排列情况吗？