使用技巧：普通光学显微镜实验操作

一、目的要求

1.了解普通光学显微镜的构造。

2.掌握普通光学显微镜的使用方法及维护。

3.能够正确使用普通光学显微镜观察微生物的形态。

二、基本原理

（一）普通光学显微镜的构造

显微镜是观察及研究微生物不可缺少的工具。由于微生物个体微小，很难用肉眼观察其形态结构，需借助显微镜，才能对微生物进行观察和研究。显微镜的种类很多，有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜等。一般对微生物的形态结构的观察，以普通光学显微镜最为常用，其构造包括机械部分和光学部分（图12-4）。

图12-4 普通光学显微镜的构造

1—粗调节螺旋 2—细调节螺旋 3—镜臂 4—推进器 5—聚光器升降螺旋

6—倾斜关节 7—接目镜 8—镜筒 9—物镜转换器 10—接物镜

11—载物台 12—聚光器 13—虹彩光圈 14—反光镜 15—镜座

1.机械部分

机械部分包括镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、推进器、聚光器升降螺旋等部件。

（1）镜座 镜座是显微镜的基座，呈马蹄形、长方形、三角形等，用以支撑整个显微镜。电光源显微镜的镜座上装有电源开关、照明光源等。

（2）镜臂 镜臂是移动显微镜的把手，上连镜筒，下连镜座，用以支撑镜筒、载物台、聚光器、调焦装置等。与镜座连接处有倾斜关节，可使镜身倾斜，有的镜臂是固定的。

（3）镜筒 镜筒上接目镜，下接物镜，形成目镜与物镜间的暗室，光线从镜筒中通过。国际上将显微镜的标准镜筒长定为160mm。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的，所以镜筒长度的变化，不仅影响放大率，也影响成像质量。

（4）物镜转换器 物镜转换器由两个金属圆盘叠合而成，可安装3～4个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个物镜和镜筒接通，与镜筒上面的目镜构成一个放大系统。在转换器上面圆盘的后方装有一个弹簧舌片，下面圆盘的侧面与每个物镜相对应的位置各有一个小凹缝。转换物镜时，必须使弹簧舌片嵌入凹缝中，才能达到正确位置，并得以固定。转换物镜时，用手指捏住转换器下的金属盘，使之旋转，不得用手捏物镜转动。

（5）载物台 载物台位于镜筒下方，呈长方形，中间有一较大圆孔，用于透光。台上装有弹簧夹和推进器，用以固定和移动标本片的观察位置。有的显微镜载物台可上下移动，由粗调节螺旋和细调节螺旋调节。

（6）粗调节螺旋和细调节螺旋 调节螺旋位于镜筒的两旁，用以调节镜筒（或载物台）的升降，以改变物镜与观察物之间的距离。要使镜筒大幅度升降时用粗调节螺旋。细调节螺旋只能使镜筒作细微升降（100μm），当旋转到极限时，不能再用力旋转，应调节粗调节螺旋，然后再反方向调节细调节螺旋。

（7）聚光器升降螺旋 聚光器升降螺旋位于载物台下面，可使聚光器升降。

2.光学部分

光学部分包括物镜、目镜、照明光源、聚光器、虹彩光圈、反光镜（电光源显微镜无反光镜）。

（1）接物镜 简称物镜，是显微镜中最重要的部分，安装在转换器的螺口上，其作用是将被检物像进行第一次放大，形成一个倒立的实像，具有辨析性能，它决定着显微镜的性能。物镜的性能取决于物镜的数值孔径。数值孔径是指光线投射到物镜上的最大角度的一半正弦与介质折射率的乘积。数值孔径越大，物镜的性能越好，油镜的数值孔径最大。

每台显微镜有3～4个接物镜，分为低倍物镜（5×～24×）、高倍物镜（40×～105×），其中90×～105×倍的物镜又称为油浸物镜，简称油镜。使用时通过镜头侧面标注的放大倍数来辨认。而且放大倍数越大的接物镜，工作距离越小，油镜的工作距离只有0.198mm（图12-5）。

图12-5 显微镜物镜参数示意图

（黄秀梨.微生物学实验指导.1999 年）

（2）接目镜 简称目镜，安装在镜筒上方，由两块透镜组成，它只能将物镜所造成的实像，进一步放大形成虚像，不具有辨析性能。每台显微镜上配有几种放大倍数的目镜（5×、10×、16×等），可供选择使用。为便于指示物像，有的目镜中装有黑色细丝作为指针。

（3）聚光器 位于载物台下方，由一组透镜组成，其作用是将光源反射来的光线聚为一束强的光锥于标本上。可根据需要，将聚光器上下调整。一般用低倍镜时降低聚光器，用高倍镜时将聚光器升起。

（4）虹彩光圈 位于聚光器下方，由十几张金属薄片组成，中心部分形成圆孔，推动光圈把手，可开大或缩小光圈，用以调节射入聚光器光线的多少。使用时，一般将虹彩光圈开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物像得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。

（5）反光镜 外光源显微镜具有反光镜。其位于镜座上，分平、凹两面，可自由旋转方向，其作用是将投射到它上面的光线反射到聚光器透镜中央，穿过透镜照明标本。当光线较强时使用平面镜，光线较弱时使用凹面镜。

（二）油镜的使用原理

细菌等原核细胞微生物个体微小，一般需要用油镜观察其形态与结构。油镜是放大倍数最大的物镜，油镜镜片极小，进入镜中光线少，造成视野较暗；当油镜头与标本片之间为空气层所隔时，因为空气的折光率与玻璃的折光率不同（空气折光率为1.00、玻璃折光率为1.52），使一部分光线被折射而不能进入油镜内，使视野更暗；如果在油镜头与标本片之间滴加香柏油（香柏油折光率为1.515，与玻璃折光率相近），就能减少因折射所造成光线的损失，使视野被充分照明，提高物镜的分辨力，使物像明亮清晰（图12-6）。(www.xing528.com)

三、材料与仪器

（1）菌种 霉菌、酵母菌、细菌和放线菌玻片标本。

（2）试剂 香柏油、二甲苯。

（3）仪器和用具 普通光学显微镜、擦镜纸等。

图12-6 油浸的作用

1—光线 2—载玻片 3—香柏油 4—空气 5—油镜

四、方法与步骤

1.取镜

从镜箱中取镜时，一只手握着镜臂，另一只手托着镜座，保持镜体直立，以防目镜、反光镜等部件脱落被摔坏。将显微镜平稳地放在实验台上，镜座距实验台边约3cm。

2.姿势

镜检者坐姿端正，要求用两眼同时通过目镜观察，也可用左眼通过目镜观察，右眼绘图或记录。

3.调光

接通电源，打开显微镜的开关。转动转换器，将低倍物镜接通镜筒。打开光圈，调节显微镜的亮度按钮以调节光的强弱，使整个视野亮度适宜。外光源显微镜通过反光镜调节光亮的强弱。

4.低倍镜观察

将低倍物镜接通镜筒。将标本片放在载物台上，使标本位于物镜正下方。转动粗调节螺旋（下降镜筒或提升载物台），使物镜距离标本约0.5cm，然后缓慢拉大物镜与标本间的距离，当出现物像时，转动细调节螺旋，直至物像清晰，再通过推进器找到理想的观察部位。使用低倍物镜可初步观察霉菌、酵母菌等，对于细菌必需进一步用油镜观察。

5.高倍镜观察

用高倍镜可更清晰地观察霉菌和酵母菌。通过低倍物镜初步观察到霉菌和酵母菌后，拉大物镜与标本之间的距离，将高倍物镜（40×或45×）接通镜筒，提升聚光镜，提高视野的亮度，慢慢缩小物镜与标本间的距离，直至二者几乎接触为止，然后通过目镜观察，转动粗调节螺旋缓慢升起镜筒（或下降载物台），即拉大物镜与标本间的距离，当出现物像时，转动细调节螺旋，直至物像清晰，用推进器将标本调到最适观察的位置，再进行观察。

观察细菌和放线菌必须使用油镜。通过低倍镜找到理想的观察部位后，拉大物镜与标本之间的距离，将油镜（100×）接通镜筒，提升聚光镜，提高视野的亮度，在标本片上加1滴香柏油，从侧面注视，转动粗调节螺旋，使油镜头慢慢浸入香柏油中，直到与标本片几乎接触为止，然后通过目镜观察，转动粗调节螺旋缓慢拉大物镜与标本之间的距离，当出现物像时，转动细调节螺旋，直到物像清晰，用推进器将标本调到最适观察的位置，再进行观察。

6.镜检后显微镜的保养

（1）取下标本片。

（2）先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，再另取一张擦镜纸滴上少量二甲苯将油镜头上的香柏油擦净，最后再用一张擦镜纸将油镜头上残留的二甲苯擦净。

（3）下降聚光器。

（4）用擦镜布（或绸布）将显微镜各部位擦净，除去灰尘、油污、水汽，以免生霉长锈。

（5）转动转换器，使物镜呈“八”字形叉开置于载物台上（或将载物台下降到最低点），盖好镜罩，将显微镜送回箱内。

五、结果报告

画出你所观察到的霉菌、酵母菌、细菌和放线菌的形态图，并注明各种菌的名称以及放大倍数。

六、复习思考题

1.使用显微镜为什么要求双眼同时睁着？

2.观察细菌时，为什么要滴加香柏油？

3.使用显微镜需要注意哪些问题？