微生物菌种的保藏和复壮实践

微生物受外界环境的影响会经常地发生小几率的变异，这种变异可能造成菌种生产性状的劣化或自身死亡。优良菌种被分离选育出来后，必须尽可能保持其原来优良的生产性状和生活力不变异、不死亡、不被污染，即做好保藏和复壮工作，以便随时供应优良菌种给生产、科研使用。

一、微生物的菌种保藏

菌种是一类重要的生物资源，菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作。在微生物发酵工业中，获得具有良好性状的生产菌种十分不容易。如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活，而且保证高产菌株不改变其表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物的高产能力，即很少发生突变，这对菌种极为重要。

（一）菌种保藏原理

微生物菌种保藏技术很多，保藏的原理基本一致。首先挑选优良纯种，最好是采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次要创造一个有利于休眠的环境条件，如采用干燥、低温、缺氧、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等方法，使微生物生长在代谢处于不活跃，生长繁殖受到抑制的环境中。

（二）菌种保藏的方法

一种良好的保藏方法首先应能保持原种的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性和简便性。菌种保藏常用方法如下。

1.低温保藏法

利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。根据所用温度的高低可分为两类：一类是普通低温保藏法，即将斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液等直接放入4～5℃冰箱中保藏，保藏时间一般不超过3个月，到时必须进行移接传代，再放回冰箱。另一类是利用超低温保藏法，用—20℃以下的超低温冰箱或干冰、液氮（—195℃）等进行冻结保藏效果很好。

2.干燥保藏法

主要是指把菌种接种到适当载体上，在干燥条件下进行保藏。能够作载体的材料很多，如土壤、细沙、硅胶、滤纸片、麸皮等，这种保藏方法主要适合于细菌的芽孢和霉菌的孢子。细菌芽孢用沙土管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。

3.隔绝空气保藏法

这种方法是利用好气性微生物无氧不生长的原理。向培养好的菌种斜面上加入灭菌石蜡油，高出斜面1cm，再用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，最后放入低温冰箱中保藏效果很好。如果不用石蜡，可以在斜面菌种长到最好时采用灭菌的橡皮塞代替原有的棉塞，塞紧试管口，放入冰箱或室温下暗处同样可以达到保藏菌种的目的。

4.真空冷冻干燥保藏法

在这类方法中，几乎利用了一切有利于菌种保藏的因素，如低温、缺氧、干燥等，因此是目前最好的一类综合性的保藏方法，保藏期长，但操作过程复杂，要求一定的设备条件。其基本过程是：培养菌种→加菌种保护剂（一般食品工业用菌种多用牛乳作保护剂）→分装、预冷冻→真空冻干→真空封口。真空冻干的菌种可在常温下长期保藏，也可在低温下保藏。

5.寄主保藏法

适用于一些难以用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。

以上介绍了菌种保藏方法的大体类别，现将常用的几种方法列于表8-3中。

表8-3 几种菌种保藏方法的比较

二、微生物的退化与复壮

（一）菌种的退化

菌株生产性状的劣化或菌株遗传标记的丢失均称为菌种退化。菌种退化是指细胞群体的变化，而不是指单个细胞的变化。当发生自发变异的单个细胞与其他细胞一起移接入新鲜培养基时，由于细胞生理、代谢调节及产生产物的不同，在某些培养条件下，发生自发变异退化细胞的数量可能逐渐增多，经过多次传代能使此变异类型完全占优势而导致细胞群体的退化。因此菌种退化是一个逐渐发展的过程。环境条件可以影响菌种退化的速率。不利环境往往加速突变型生产菌向野生型方向退化。但这种退化还需从群体细胞的生产性状来分析，单纯环境条件如碳源、氮源、pH、温度等造成生产性状的下降是因批而异的，下一次发酵可以完全恢复正常，菌种本身并没有变化，这不是退化。同样，由于杂菌污染导致生产性状下降也不是退化，通过采取对设备的清洗、维修、重新杀菌等一系列措施，加强无菌操作，可以避免杂菌的继续污染；只有菌株本身性状的劣化才是退化。

常见的菌种退化现象中，最易觉察到的是菌落形态和细胞形态的改变，如菌落颜色的改变、畸形细胞的出现等。其次是生长变得缓慢，产孢子越来越少，例如放线菌、霉菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难。再次是菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗生素产生菌产抗生素的减少，枯草杆菌产淀粉酶能力的衰退等。所有这些都对发酵生产不利。

（二）菌种退化的原因

菌种退化的主要原因是基因的负突变。与控制生产性状有关的基因的负突变可造成生产性状的严重劣化。以工业生产核苷酸或氨基酸的营养缺陷型菌种为例，缺陷型基因发生回复突变可使产量性状下降很大。这种个别细胞的回复突变频率很低，但由于具有生长优势，在传代过程中在数量比例上上升很快，尽管此时就斜面菌种而言退化细胞还只是少数，但发酵过程中这少数菌的存在会使退化性状表现强烈，最终成为一株退化了的菌株。由此可见，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施而一味移植传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，从而使整个群体表现出严重的退化现象。

（三）防止菌种退化的措施

根据菌种退化原因的分析，可以制定出一些防治退化的措施，主要从四方面考虑。

1.控制传代次数

即尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突变的几率。众所周知，微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的。据研究证明，DNA在复制过程中碱基发生差错的几率低于5× 10^-4，一般自发突变频率在10^-8～10^-9之间。从这里可看出，菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。所以不论在实验室还是在生产实践中，尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代控制在最低水平，以降低自发突变的概率。

2.创造良好的菌种培养条件

在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化。各种变异的生产菌株对培养条件的要求和敏感性不同。要满足变异菌株的生长要求，并控制培养条件防止菌种退化：①给予营养缺陷型菌适当的营养必需成分可以降低回复突变频率；②给予抗性菌以一定浓度的药物，可以使回复的敏感型菌株的生长受到抑制，而生产菌能正常生长；③控制培养基中氮源或碳源的性质，使之有利于生产菌株而不利于退化菌株的生长，从而限制退化菌株的数量上升；④改变培养pH、温度等条件防止退化。如栖土曲霉3.942的培养中，使培养温度由28～30℃提高到30～34℃防止了产孢子能力的衰退。由于微生物生长可使培养基成分发生变化，积累有毒害性物质，因此生产中应避免使用陈旧的培养物作为种子。

3.利用不同类型的细胞进行移种传代

在放线菌和霉菌中，由于其菌丝细胞常含有几个核甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退。而孢子一般是单核的，用它接种时，就没有这种现象发生。有人在实践中采用灭过菌的棉团轻巧地蘸取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。还有人发现，构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改为子囊孢子移种传代则不易退化。(www.xing528.com)

4.采用有效的菌种保藏方法

保藏温度影响自发突变且影响细胞活力。因此，有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种退化。例如斜面保藏于4℃时，突变的可能性大，且斜面保藏一般每3个月到半年需传代1次，这对菌种不利。因此作为生产菌株需同时采用斜面保藏和其他的保藏方式如冷冻干燥孢子、砂土管及液氮保存等，后几种方式可大大减少传代的次数。斜面保藏菌也应使每次传代的斜面足够在生产上使用相当长时间，以减少传代次数。保藏所用的斜面培养基组成应根据不同菌种的特性加以选择。

（四）退化菌种的复壮

狭义的复壮是指从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以恢复菌种的原有典型性状；广义的复壮则指在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。所以这实际上是一种利用自发突变（正突变）不断从生产中进行选种的工作。

退化菌种复壮的方法主要有以下几种。

1.纯种分离

通过纯种分离，可把退化菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法有平板稀释法、单细胞或单孢子分离法等。

2.通过寄主体进行复壮

对于寄生性的退化菌株，可回接到相应寄主体上，以恢复或提高其寄生性能。例如根瘤菌属经人工移接结瘤固氮能力减退，将其回接到相应豆科寄主植物上，令其侵染结瘤，再从根瘤中分离出根瘤菌，其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。

3.淘汰已衰退的个体

例如对“5406”放线菌的分生孢子采用—30～—10℃处理5～7d，其死亡率达80%，在抗低温的存活个体中，留下了未退化的健壮个体。

以上介绍了一些在实践中收到一定效果的防止衰退和达到复壮的方法和经验。但必须强调的是，在采取这类措施之前，要仔细分析和判断一下菌种是发生了衰退，还是仅属一般性的表型变化，或只是杂菌的污染而已。只有针对不同的情况才能使复壮工作奏效。

本章小结

基因突变指生物体内的遗传物质发生了稳定的可遗传的变化。基因突变的主要类型有营养缺陷型、条件致死突变型、形态突变型、抗性突变型、产量突变型等。基因突变的特点是自发性和不对应性，自发突变概率低，具有独立性、稳定性、诱变性和可逆性。基因突变的种类主要是诱发突变和自发突变。基因重组是将两个不同性状的个体细胞内的遗传基因转移在一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传型个体的过程。原核微生物的基因重组方式主要有转化、转导、结合和溶原性转变等四种。真核微生物的基因重组方式有有性杂交和准性生殖。微生物菌种选育的方法：一是从自然界中分离所需的菌种，即从土壤中分离菌种；二是微生物诱变育种；三是杂交育种；四是原生质体融合。微生物菌种保藏是指创造一个有利于菌种休眠的条件，如采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，使微生物生长在代谢不活跃、生长受抑制的环境。菌种保藏方法有低温保藏法、干燥保藏法、隔绝空气保藏法、真空冷冻干燥法及寄主保藏法等。菌种退化的主要原因是基因的负突变，从而影响代谢产物的数量与质量。防止菌种退化的措施是控制传代次数、创造良好的培养条件、利用不同类型的细胞进行移种传代和采用有效的菌种保藏方法等。退化菌种复壮的方法主要有纯种分离、淘汰已衰退的个体、通过寄主体进行复壮。

复习思考题

1.什么是微生物的遗传和变异？它们的物质基础是什么？如何证明？

2.试从不同水平说明遗传物质在细胞中的存在形式。

3.什么是基因突变、正向突变、回复突变、突变率？基因突变的类型和特点是什么？

4.什么是诱发突变？什么是诱变剂？其种类有哪些？

5.什么叫碱基对置换（转换和颠换）、移码突变、染色体畸变？试述诱发突变的分子机制。

6.什么叫诱变育种？简述诱变育种的操作方法和步骤。

7.什么叫自发突变？试述自发突变的分子机制；如何利用自发突变的原理进行育种？

8.什么叫重组？什么叫杂交？原核微生物和真核微生物各有哪些基因重组形式？

9.什么叫转化？什么是感受态？什么是转化子？试述转化的一般过程。

10.什么叫转导？什么叫普遍性转导和局限性转导？试比较普遍性转导和局限性转导的异同。

11.什么叫缺陷型噬菌体？简述其形成过程和在转导中的作用。

12.试比较大肠杆菌的F⁺、F^-、Hfr和F′菌株的异同，并用图示说明四者之间的相互关系。

13.什么叫溶源转变？它与转导的区别是什么？

14.什么叫原生质体融合？其操作步骤如何？该育种技术在实践中有何重要意义？

15.什么是基因工程？其基本原理和操作步骤如何？

16.菌种为什么会退化？防止菌种退化的措施有哪些？

17.现有的微生物菌种保藏法可分为几类？试比较几种常见的菌种保藏法。