微生物菌种选育技巧详解

菌种选育，就是利用微生物遗传物质变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的菌株，以提高产品质量或发展新品种。

在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品及其代谢产物时，首先要挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。其次是根据菌种的遗传特点，改良已有菌种的生产性能，使产品的产量和质量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它复壮，这便是菌种复壮工作的任务。另外还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。

一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤

生产上使用的微生物菌种，最初都是从自然界中筛选出来的。自然界的微生物种类非常多，分布极广，它们在自然界多是以混杂的形式群居在一起的。要从自然界找到我们需要的菌种，就必须把它从许许多多不同的杂菌中分离出来，然后根据生产上的要求和菌种的特性，采用各种不同的筛选方法，挑选出性能良好、符合生产要求的纯种。自然界工业菌种分离筛选的主要步骤有采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等几个步骤。如果产物与食品制造有关，还需对菌种进行毒性鉴定。

（一）采样

从何处采样，要根据选菌的目的、微生物的分布状况及菌种的特征与外界环境的关系等，进行综合的具体的分析来决定。

由于土壤是微生物生活的大本营，其中包括各种各样的微生物，因此，如果我们不知道生产某种产品的微生物属类及某些特征时，一般都可以土壤为样品进行分离。但是，微生物的存在及数量和种类常随土质的不同而不同，一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红壤中及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母菌和霉菌较多，浅层土比深层土中的微生物多，一般离表层5～15cm深处的微生物数量最多。

采样应充分考虑季节性和时间因素，以温度适中、雨量不多的秋初为好。采样的方法是在选好合适地点后，用小铲子除去表层土，然后用无菌刮铲、土样采集器等取离地面5～15cm的土壤几十克，盛入预先消毒过的牛皮纸袋、聚乙烯袋或玻璃瓶中，扎好并标上样本的种类、采样的地点、时间以及环境情况等，以备查考。

如果我们知道所需菌种的明显特征，则可直接采样。例如分离啤酒酵母可直接从酒厂的酒糟中采样；分离抗噬菌体的新菌株可以从污染噬菌体的发酵液中采样；分离能利用糖质原料、耐高渗的酵母菌可以采集加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境土壤等。

（二）增殖培养

在一般情况下，采来的样品都可直接进行分离。但如果样品中我们所需要的微生物数量不够多时，就得设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率，这种人为的增加该菌种数量的方法称为增殖培养法（也称富集培养法）。

进行增殖培养时，要根据所分离菌种的培养条件、生理特征来确定特定的增殖条件，其手段是通过选择性培养基控制营养条件、生长条件或加入一定的抑制剂等（见表8-2），其目的是使其他微生物尽量处于抑制状态，要分离的微生物（目的微生物）能正常生长，以便使所需微生物增殖后在数量上占绝对优势。

表8-2 某些细菌增殖培养条件的控制

*基础培养基：酵母膏10g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.2g，水1000mL。

（三）纯种分离

通过增殖培养，具有某一特性的微生物大量存在，但它不是唯一的，仍有其他类型的微生物与其混杂生长。为了取得所需微生物的纯种，就必须对此进行分离和纯化，常用的纯种分离方法有稀释分离法、平板划线分离法和组织分离法三种。

1.稀释分离法

将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布接种于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。

2.平板划线分离法

首先倒培养基平板，然后用灭菌的接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线。划线方法可分为分步划线法和一次划线法，无论用哪种方法，基本原则都是确保培养出单个菌落。

3.组织分离法

组织分离法主要用于食用菌菌种的分离，是以食用菌的子实体等作为材料进行分离的方法。分离时，首先用10%漂白粉水或75%酒精对食用菌的子实体进行表面消毒，并用无菌水洗涤数次后，以无菌操作手续切取一小块组织，移置于固体培养基上，于适宜温度下进行培养，数天后就可以看到从组织块周围长出菌丝，并向外扩展生长。

（四）纯种培养

纯种培养是将分离到的目的菌种接种到试管斜面上培养扩大的培养方法。经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌体形态鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可转移到试管斜面进行纯种培养。

（五）生产性能测定

从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶进行小型发酵试验进行发酵生产性能的测定，然后才能决定取舍。

需要特别指出的是刚从自然界分离筛选出来的菌种，一般来讲，其发酵生产活力往往还是比较低的，不能够达到生产的要求。因此还必须经过多次重复筛选，结合研究它们在形态和生理上的特点，找出它们生长和发酵生产的最适培养条件，并进行菌种的选育工作以便满足生产之需要。

二、微生物的诱变育种

诱变育种就是利用物理的或化学诱变剂处理均匀分散的微生物群体，促进其突变频率大幅度提高，从中挑选少数符合育种目的的突变菌株，以供生产实践或科学实验之用。

诱变育种的主要手段是用合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞，引起绝大多数细胞死亡，使存活细胞的突变频率迅速提高，再设计既简单、快速又高效的筛选方法，进而淘汰负变菌株，并把正变菌株中少数变异幅度最大的优良菌株巧妙地挑选出来。

诱变育种具有极其重要的实践意义。当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的突变株。其中最突出的例子就是青霉素生产菌株的选育。1943年，产黄青霉每1mL发酵液只产生约20单位的青霉素，通过诱变育种和其他措施配合，目前的发酵单位已比原来提高了三四千倍，达到每1mL 5万～10万单位。

诱变育种不仅能提高菌种的生产性能而增加产品的产量，而且还可以达到改进产品质量，扩大品种和简化生产工艺等目的。从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，虽然目前在育种方法上，杂交、转化、转导以及基因工程、原生质体融合等方面都在快速地研究发展着，但是诱变育种仍为目前最主要最广泛使用的育种手段。

（一）诱变育种的步骤

诱变育种的一般步骤见图8-9。

图8-9 诱变育种的一般步骤

1.出发菌株的选择

出发菌株是用于诱变育种的原始菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择会直接影响最后的诱变效果。经常用作出发菌株的有以下三类：第一类是新从自然界分离的野生型菌株，这类菌株的特点是对诱变因素敏感，容易发生变异，而且容易向好的方向变异，产生正向突变。第二类是诱变育种中经常采用的，对在生产中由于自发突变而经筛选得到的菌株进行诱变，这类菌株类似野生型菌株，容易得到较好的诱变结果。第三类是对已经诱变过的菌株进行再诱变，这也是诱变育种工作中经常采用的，选取每次诱变处理产量都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果叠加。

2.同步培养

在诱变育种中，一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子，诱变处理前，菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，培养生理活性一致的细胞方法，称同步培养法。

3.单细胞或单孢子菌悬液的制备

在诱变育种中要求待处理的菌悬液呈分散的单细胞或单孢子状态，这样一方面可以均匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。

菌悬液一般可用生理盐水或缓冲液配制，特别是用化学诱变剂处理的，因处理时pH会变动，必须要用缓冲液；其次，还应注意分散度，采用的方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经过如此处理，分散度可达90%以上，供诱变处理较为合适。此外，菌悬液还要有合适的浓度，一般处理霉菌孢子或酵母菌细胞悬浮液的浓度大约为10⁶个/mL，放线菌或细菌密度大些，可在10⁸个/mL左右。悬浮液的细胞数可用平板活菌计数，也可用血球计数器或光密度法测定，但以平板活菌计数较为准确。

4.诱变剂选择与诱变剂剂量确定

诱变剂主要有两大类，即物理诱变剂和化学诱变剂。

（1）物理诱变剂 常用的有紫外线、X射线、γ射线和快中子、超声波等，其中最常用的是前三种。

由于紫外线不需什么特殊贵重设备，只要有一支用于灭菌的紫外灯管就能做到，而且诱变效果也很显著，因此是目前使用最广泛的一种诱变剂。为了避免光复活作用，应在暗室的红光下操作，处理完毕后，应将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，而后再进行分离筛选。

不同的微生物对于紫外线的敏感程度是不一样的，因此不同的微生物对于诱变所需要的照射剂量是不同的。紫外线的照射剂量可以相对地按照紫外灯的功率、照射距离和照射时间来决定。最好使照射后微生物的存活率在5%以下为宜。

X射线和γ射线二者都是高能电磁波，两者性质相似。生物学上应用的X射线一般由X光机产生，γ射线来自放线性元素钴、镭、氡等。X射线和γ射线诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。不同的微生物对X射线和γ射线的辐射敏感程度差异很大，可以相差几百倍，引起最高变异的剂量也随菌种有所不同。一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在103～258C/kg，或者采用能使微生物产生90%～99%的死亡率的剂量。

（2）化学诱变剂 化学诱变剂的种类极多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类。第一类是烷化剂，例如硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亚硝基脲（NMU）、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。第二类是碱基类似物，例如5—溴尿嘧啶、5—氨基尿嘧啶、2—氨基嘌呤、8—氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类化合物。

决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用微克至毫克级，但是这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些情况下诱变剂延迟作用的影响。一般对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物有一个大致范围，在进行预试验时，也通常是将浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。

要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而提高，但达到一定剂量后，再提高剂量反而会使诱变频率下降。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中，还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低（30%～70%）的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。

诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种工作具有实际意义。因此有时可根据情况，采用多种诱变剂复合处理。复合处理方法主要有三类：第一类是两种或多种诱变剂的先后使用，第二类是同一种诱变剂的重复使用，第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。

5.分离和筛选

近年来，人们为了缩短筛选周期，尽量减少不必要的工作量，往往对筛选方法加以简化，以代替大量的摇瓶培养工作，并将初筛与复筛两个阶段结合在一起进行，其目的是利用形态突变直接淘汰低产变异菌株和利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养皿平板上作用后表现出的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等的大小，这些效应的大小表示了变异菌株生产活力的高低，所以可以作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。

（1）纸片培养显色法 此方法适用于多种生理指标的测定，如淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）大小的测定、氨基酸显色圈（转印到滤纸上，再用茚三酮显色）大小的测定、柠檬酸变色圈（用溴甲酚蓝作指示剂）大小的测定等，来估计相应代谢产物的产量。下面以筛选柠檬酸产生菌为例介绍其具体方法：将与培养皿大小一致的滤纸片预先浸入含有0.02%指示剂溴甲酚蓝的培养基中，再把滤纸片放在培养皿中，用4只牛津小杯搁起，中央放一小块浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，用接种环将适当浓度的菌悬液接种到滤纸上，然后保温培养，即可见到菌落周围因产酸而显示出变色圈，最后由变色圈和菌落直径的比值可测定出该菌的产酸能力。

（2）透明圈法 有人将产蛋白酶的酱油曲霉突变体用紫外线处理，使之再变异，然后在含酪素的琼脂培养基上使其长出菌落，利用菌落周围透明圈的大小，选出了优良高产菌株U₃₄，该菌的产酶活性约为出发菌株的6倍。

（3）琼脂块培养法 此法是筛选抗生素产生菌较理想的一种方法，具体做法是：将诱变后的孢子悬液涂布在琼脂平板上，29℃培养2d，待长出稀疏的小菌落后，用打孔器取出长有单菌落的琼脂小块，并把它整齐地放入灭过菌的空培养皿中，保持一定温湿度，在29℃继续培养4～5d，使其产生抗生素并分泌在琼脂块内，然后将这些琼脂块移置于铺有试验菌的大方盘内，在29℃培养17～18h，观察抑菌圈的大小，选取抑菌圈大的转接于斜面。此法的特点是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块并对其进行分别培养。在这种情况下，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生代谢产物无处扩散，因此测的数据与摇瓶培养十分相似，然而工作效率却大大提高了。

（二）营养缺陷型突变株的筛选及应用

在诱变育种工作中，营养缺陷型突变株的筛选及应用有着十分重要的意义。营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某种营养物质（如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等）的能力，必须在基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生产繁殖的变异菌株。其变异前的原始菌株称为野生型菌株。凡是能满足野生型菌株正常生长的最低成分的合成培养基，称为基本培养基（MM）；在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基（CM）。在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种其自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基，称为补充培养基（SM）。

营养缺陷型菌株不论在科学实验中还是在生产实践中都有十分重要的意义。在科学实验中，它既可作为研究代谢途径和转导、转化、接合及杂交等遗传规律必不可少的标记菌种，也可作为氨基酸、维生素或含氮碱基等物质生物测定的试验菌种。在生产实践中，它既可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌，也可作为生产菌种杂交育种时所必不可少的带有特定标记的亲本菌株。

1.营养缺陷型菌株筛选的一般方法

筛选营养缺陷型菌株一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型菌株和鉴定营养缺陷型四个环节。(www.xing528.com)

（1）诱变剂处理 与其他诱变处理相同。

（2）淘汰野生型菌株 在诱变处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之几至千分之几，通过抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到“浓缩”营养缺陷型的目的。

（3）检出营养缺陷型菌株 主要有夹层培养、限量补充培养、影印接种、逐个检出四种检出营养缺陷型菌株的方法。

（4）鉴定营养缺陷型 经过营养缺陷型的检出，确定菌株为营养缺陷型菌株后，就需测定它到底是哪种类型的营养缺陷型。是氨基酸缺陷型，还是维生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型？如果是氨基酸缺陷型，还需要确定是什么氨基酸缺陷型，通常用生长谱的方法鉴定。

2.营养缺陷型菌株的应用

营养缺陷型菌株在微生物学中应用很广，主要有以下几个方面。

（1）利用营养缺陷型菌株定量分析各种生长因素的方法称为微生物分析法。这种方法特异性强，灵敏度高，所用样品可以很少而且不需经过提纯，也不需要复杂的仪器设备。因此常用于分析食品中维生素和氨基酸的含量，因为在一定浓度范围内，营养缺陷型菌株生长繁殖的数量与其所需维生素和氨基酸和含量成正比。

（2）利用营养缺陷型菌株测定微生物的代谢途径。通过有意识地控制代谢途径，获得更多我们所需要的代谢产物，从而成为发酵生产核苷酸、氨基酸或各种维生素等的生产菌种，例如利用腺苷酸缺陷型菌株可提高肌苷酸的产量等。

（3）利用营养缺陷型菌株作为研究转导、转化、接合等遗传规律的标记菌种，在微生物杂交育种中常作亲本的标记。由于对大多数不能进行有性繁殖的微生物进行杂交育种时，主要是通过准性生殖的方式进行，但结合后形成的杂种在形态上往往与亲本不能区别，因此常常选择不同的营养缺陷型来进行标记，通过测定后代的营养特性，以判定它们杂交的性质。

三、微生物的杂交育种

杂交育种是指将两个基因型不同的菌株的有性孢子或无性孢子及其细胞相互联结，细胞核融合，随后细胞核进行减数分裂或有丝分裂，遗传性状出现分离和组合，产生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。由此可见，微生物的杂交现象包括有性杂交以及菌体细胞重组两个方面。

尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法，但是某一菌株在长期诱变处理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢等。而杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂交育种的方法复杂、工作进度慢，因此还很难像诱变育种那样得到普通的推广和应用。

（一）酵母菌的杂交育种

酵母菌的育种在食品工业中占有极其重要的地位。它的杂交育种工作开展得也较早，并取得了有益的成果。例如在面包酵母的种间进行杂交，获得了许多生产性能良好的菌株，它们的繁殖能力和发酵能力都比亲本菌株强；采用面包酵母和酒精酵母杂交，其杂交种的酒精发酵能力没有下降而发酵麦芽糖的能力却比亲本菌株高，在酒精发酵后，它还可供面包厂发酵面包用；在啤酒酿造中，用上面酵母和下面酵母杂交，得出的杂交种可生产出浓度和香味更好的啤酒等。以上这些都是通过酵母菌的有性杂交获得，因为这些菌株均具有不同的交配型。对于无典型有性生殖的酵母如假丝酵母，可通过准性生殖过程进行杂交。但是酵母菌的杂交育种大多数为有性杂交。

酵母菌通过有性杂交进行杂交育种主要包括子囊孢子的形成、子囊孢子的分离和酵母杂交种的获得三个步骤。

1.酵母子囊孢子的形成

一般生产上用的酵母菌如啤酒酵母、面包酵母等，因长期在实验条件下培养，会引起产生孢子能力衰退，一般很难形成子囊孢子。因此，要使酵母菌形成子囊孢子就需要用特殊的酵母菌产生子囊孢子培养基。比较有效的产孢子培养基是醋酸钠琼脂培养基：无水醋酸钠0.82g，氯化钾0.186g，琼脂2g，水100mL。将大量的不同生产性状的甲、乙两个酵母菌亲本（双倍体）分别接种到该培养基的斜面上，在25～27℃培养2～3d即可产生子囊孢子。

2.子囊孢子的分离

用几毫升蒸馏水洗下子囊，加入1mL液体石蜡和5g硅藻，在匀浆器中研磨10min，弄破子囊，然后在离心机（4500r/min）中离心10min，子囊孢子就会集中在最上层的石蜡层中。也可用蜗牛消化液酶解子囊壁，激烈振荡，使其成单个孢子，所得悬液再添加液体石蜡，振荡后子囊孢子也会集中在上层的石蜡层中。

3.杂交种的获得

取集中子囊孢子的液体石蜡0.05mL，加0.05mL 15%的明胶，涂布于培养皿的平板上，就可获得单倍体的菌落。将两种不同交配型的单倍体酵母菌混合培养在麦芽汁中过夜，当镜检时发现有大量的哑铃形接合细胞时，就可接种到微滴培养液中培养，形成2倍体细胞，就是杂交种。这就是最常应用的群体交配法。也可借助显微操纵器将不同交配型的子囊孢子直接配对，进行微滴培养，使之发芽结合，形成杂交种。但这个方法既需仪器又费工。还有一种方法是单倍体细胞交配法，是用两种不同交配型的酵母细胞直接配对放在微滴培养基中进行培养，当在显微镜下观察到合子形成时，就是杂种，但此法不易成功。

（二）霉菌的杂交育种

目前在发酵生产中应用的霉菌大部分是属于半知菌，它们不具有典型的有性生殖过程，因此霉菌的杂交育种主要是通过体细胞的核融合和基因的重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞的融合。例如：酱油曲霉通过体细胞的重组及多倍体化，提高了蛋白酶活性及曲酸的产量；通过对黑曲霉的杂交育种，得到了多倍体的新种，其柠檬酸产量比原始菌株高几十倍等。目前霉菌的杂交育种主要是在种内，偶尔有种间的。但亲本菌株的亲缘关系越远，则越不易成功。

霉菌的杂交育种包括以下几个步骤。

1.选择直接亲本

即选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作杂交亲本菌株。由于在荨麻青霉等不产生有性孢子的霉菌中，只有极个别的细胞间才发生联结，而且联结后的细胞在形态上无显著的特征可找，因此，必须借助营养缺陷型来作为杂交亲本菌株，才能测知杂交的程度。

2.异核体的形成

将A^-B ⁺和A⁺B^-缺陷型菌株所产生的分生孢子（含量为10⁶～10⁷个/mL）混合，用基本培养基倒培养皿培养，同时也用单一亲本的分生孢子分别倒基本培养基平皿培养。经过培养后，要求前者只出现几十个菌落，而后者却不长菌落。这时，出现在前者上的菌落便是由A^-B ⁺和A⁺B^-体细胞联结形成的异核或杂合二倍体菌落。

3.转移单菌落

将培养皿上长出的这种异核体单菌落移接到基本培养基的斜面上。

4.双倍体的检出

就是检验新菌株是不稳定的异核体还是稳定的杂合二倍体。首先将斜面上的孢子洗下，用基本培养基倒夹层平板，经培养后，再加上一层完全培养基。这时，如果在基本培养基上不出现或出现少数菌落，而当加上完全培养基后却出现大量菌落，这便证明是一个不稳定菌株——异核体。如果在基本培养基上出现多数菌落，而加入完全培养基后，菌落数并无显著增加，这便证明是一个稳定菌株——杂合二倍体。在实际工作中，多数菌株属于不稳定的异核体。

5.诱变处理并促进变异

将稳定菌株产生的分生孢子用紫外线、γ射线或氮芥等诱变剂进行处理，以促进其发生染色体交换、染色体在子细胞中分配不匀、染色体畸变或缺失以及点突变等，从而使分离后的杂交子代（单倍体杂交子）增加新遗传性状的可能性。

在上述工作的基础上，再经过生产性状的测定，就有可能筛选到比较理想的菌株。

（三）细菌的杂交育种

根据实验，一般大约10⁶个细菌中才会出现一个基因重组体。所以如果不采用营养缺陷型具有标记的菌种和不采用选择性培养基，是很难发现这类重组体的。因此在细菌杂交育种前首先要获得标记菌种，并设计好选择性培养基，另外进行细菌杂交必须选择具有F因子可亲和的细胞。

在发酵工业中，细菌的杂交育种工作报道很少，也还未能很好地应用，但是，目前也进行了一些具有应用潜力的试验。例如，肺炎克氏杆菌具有固氮能力，大肠杆菌不能固氮，在大肠杆菌中诱变出组氨酸缺陷型和抗链霉素突变株，把这一突变株和野生型的肺炎克氏杆菌混合，接种到有链霉素的基本培养基上，就可形成杂交种菌落。

四、原生质体融合育种

通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。由此法获得的重组子称为融合子。原核生物原生质体融合研究是从20世纪70年代后期才发展起来的一种育种新技术，是继转化、转导和接合之后发现的一种较有效的遗传物质转移手段。

能进行原生质体融合的细胞不仅有原核生物中的细菌、放线菌，而且还有真核微生物中的酵母、霉菌以及高等动、植物细胞。原生质体融合技术有许多优越性，它打破了微生物的种属界限，可以实现远缘菌株间的基因重组；可使遗传物质传递更完整，可快速组合性状，加速育种速度；可借助聚合剂同时将几个亲本的原生质体随机地融合在一起，获得综合几个亲本性状的重组体。

原生质体融合的主要操作步骤是：先选择两株有特殊价值并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本菌株置于等渗溶液中，用适当的脱壁剂（如细菌和放线菌可用溶菌酶等处理，真菌可用蜗牛消化酶或其他相应酶处理）去除细胞壁，再将形成的原生质体（包括球状体）进行离心聚集，加入促融合剂PE G（聚乙二醇）或借电脉冲等促进融合，然后用等渗溶液稀释，再涂在能促使它再生细胞壁和进行细胞分裂的基本培养基平板上。待形成菌落后，再透过影印平板法，把它接种到各种选择性培养基平板上，检验它们是否为稳定的融合子，最后再测定其有关生物学性状或生产性能（见图8-10）。

原生质体融合育种具有重组率高、遗传物质的传递更加完整、可以实现远亲缘菌株间的基因重组，还可以进行多细胞间的基因重组等优点。因此，利用原生质体融合选育新菌株已受到国内外的普遍重视。原生质体融合已成为微生物遗传育种的有效工具，必将为应用微生物工业带来勃勃生机。

五、基因工程育种

自进入20世纪70年代后，由于分子生物学、分子遗传学和核酸化学等基础理论的发展，产生了一种新的育种技术——基因工程。基因工程又称遗传工程，它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后（或用人工合成的基因），把它和作为载体的DNA分子连接起来进行基因重组，然后通过转化或转导手段将这种新的重组DNA分子导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一项崭新的育种技术。这是一种自觉的、可人为操纵的体外DNA重组技术，是一种可达到超远缘杂交的育种技术，更是一种前景宽广、正在迅速发展的定向育种新技术。

图8-10 原生质体融合技术

基因工程的基本操作包括目的基因的取得，载体系统的选择，目的基因与载体重组体的构建，重组载体导入受体细胞，“工程菌”或“工程细胞株”的表达、检测以及一系列生产性试验等。其主要操作过程见图8-11。

图8-11 基因工程基本操作步骤

1.目的基因的取得

选择目的基因的途径有三种：选择适宜的供体细胞，以便从中采集分离到有生产意义的目的基因；通过逆转录作用由mRNA合成cDNA（互补DNA）；用化学方法合成特定功能的基因。

2.选择载体

载体必须具备下列几个条件：是一个有自我复制能力的复制子；能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率；载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载DNA的一定位置上；载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”选择出来。目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒（松弛型）和λ噬菌体两类。真核受体细胞的载体主要有SV40病毒（动物方面）和Ti质粒（植物方面）。

3.目的基因与载体DNA的体外重组

对目的基因与载体DNA均采用限制性内切酶处理，从而获得互补黏性末端或人工合成黏性末端，然后把两者放在较低的温度（5～6℃）下混合“退火”。由于每一种限制性内切酶所切断的双链DNA片段的黏性末端有相同的核苷酸组分，所以当两者相混时，凡黏性末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双链。这时，在外加连接酶的作用下，供体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被“缝合”，形成一个完整的有复制能力的环状重组体。

4.重组载体引入受体细胞

体外反应生成的重组载体只有将其引入受体细胞后，才能使其基因扩增和表达。受体细胞可以是微生物细胞，也可以是动物或植物细胞。把重组载体DNA分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作为载体时，可以用转化的手段；若以病毒DNA作为重组载体时，则用感染的方法。

5.复制、表达

在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，从而使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状，受体细胞就成了“工程菌”。

6.筛选、繁殖

当前，由于分离纯净的基因功能单位还很困难，所以通过重组后的“杂种质粒”的性状是否都符合原定的“设计蓝图”，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等，都还需要经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个体，然后才可加以繁殖和利用。

基因工程虽是在20世纪70年代初才开始发展起来的一个遗传育种新领域，但由于它反映了时代的要求，因而进展极快，在应用方面的巨大潜力已经表现出来。例如，1977年报道了人脑激素基因转移到大肠杆菌中并获得发酵产品人脑激素。1978年美国有两个实验室合作，将大白鼠的胰岛素基因经过体外加工，成功地植入大肠杆菌并制造出胰岛素。1982年我国将人工合成的脑菲肽（大脑中的一种镇搐物质）基因（含26个核苷酸的双链）移植到大肠杆菌中并实现了表达，同时把人干扰素基因移植到大肠杆菌中合成干扰素的工作也已获成功；1984年上海药物研究所又采用基因工程制成了具有高活性青霉素酰化酶基因的“工程菌”。所有这些成就已在全世界引起巨大反响。有人估计，用基因工程方法获取新种要比自然进化的速度提升1亿至10亿倍，利用基因工程进行育种工作的出现，为遗传育种工作者提出了一系列具有吸引力的研究课题，同时也为有关工作展示了一幅光辉灿烂的美好前景。