微生物生长与繁殖的相关性及指标测定方法

微生物不论其在自然条件下还是在人工条件下发挥作用，都是“以数取胜”或是“以量取胜”的。生长、繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。可以说，没有一定的数量就等于没有微生物的存在。

一、微生物生长的概念

微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地说，生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个基本相同的子细胞，子细胞又重复以上过程。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其质量、体积、密度或浓度作指标来衡量。所以：群体生长＝个体生长+个体繁殖。

这里需要强调的是，上述微生物生长的阶段性，对于单细胞微生物来说是不明显的，往往在个体生长的同时，伴随着个体的繁殖，这一特点，在细菌快速生长阶段尤为突出，有时在一个细胞中出现2或4个细胞核，除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有实际意义，因此，在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。这一点与研究高等生物时有所不同。微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程，这是个体生长的定义。繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。可以看出微生物的生长与繁殖是两个不同但又相互联系的概念。生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时，往往将这两个过程放在一起讨论，这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。

微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映，因此，生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标。同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病、霉腐微生物的防治，也都与它们的生长繁殖和抑制紧密相关。在发酵工业中要提供最适的条件，以利于微生物的生长、繁殖和发酵；但在食品加工中，要研究最佳的灭菌方法和抑制微生物在食品中生长和繁殖的条件，保证食品的卫生、安全，延长食品的货架期。本章第二、三节对微生物的生长繁殖及其控制的规律作了较详细的介绍。

二、微生物生长量的测量

既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也均直接地以此为根据，而测定繁殖则要建立在计数这一基础上。

1.稀释平板菌落计数法

稀释平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上，在最适条件下培养后，用平板上出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个9cm直径的培养皿平板上，一般以出现50～500个菌落为宜。

这种方法在操作时有较高的技术要求，其中最重要的是应使样品充分混匀，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。有人认为，对原菌液浓度为10⁹/mL的微生物来说，如果第一次稀释即采用10^-4级（将10μL菌液移至100mL无菌水中），第二次采用10^-2级（将1mL稀释液移至100mL无菌水中），然后再吸此菌液0.2mL进行表面涂布和菌落计数，则所得的结果最为精确。其主要原因是，一般的吸管管壁常因存在油脂而影响计数的精确度（有时误差竟高达15%）。(www.xing528.com)

2.血球计数板法

血球计数板法是用来测定一定容积中的细胞总数的常规方法。这种方法的特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等。此外测定结果是微生物个体的总数，其中包括死亡的个体和存活的个体，要想测定活菌的个数，还必须借助其他方法配合。

3.称干重法

称干重可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%～20%。在离心法中，将待测培养液放入离心管中，用清水离心洗涤1～5次后，进行干燥。干燥温度可采用100℃、105℃或红外线烘干，也可在较低的温度（80℃或40℃）下进行真空干燥，然后称干重。以细菌为例，一个细胞一般重10^-13～10^-12g。

另一种方法为过滤法。丝状真菌可用滤纸过滤，而细菌则可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤。然后在40℃下真空干燥，称干重。以大肠杆菌为例，在液体培养物中，细胞的浓度可达2×10⁸个/mL。100mL培养物可得10～90mg干重的细胞。这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。

4.比浊法

细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高，最古老的比浊法是采用莫法兰（MoFarland）比浊管。这是用不同浓度的BaCl₂与稀H₂SO₄配制成的10支试管，其中形成的BaSO₄有10个梯度，分别代表10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液只要在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者透光度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。

如果要做精确测定，则可用分光光度计进行，在可见光的450～650nm波段内均可测定。为了对某一培养物内的菌体生长做定时跟踪，可采用不必取样的侧壁三角烧瓶来进行。测定时，只要把瓶内的培养液倒入侧臂管中，然后将此管插入特制的光电比色计比色座孔中，即可随时测出生长情况，而不必取用菌液。

以上介绍了若干测定微生物的生长量或计算繁殖数的主要方法，其中，最常用的为称干重、测浊度（用分光光度计）、用计数板测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。必须指出的是，不管用什么方法，均有其优缺点和使用范围。所以，在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。