精准实用的光遗传学技术方法

1．光遗传技术的发展

在光遗传技术出现之前，科学家和医生是通过其他方法定位研究对象的。如超声波方法、电磁方法和光学方法。如图4-3（见书后彩图）。

ES方法主要是提供区域定位，但是不提供特定的神经类型；而经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）一种通过发射磁辐射来暂时打开或关闭神经回路的工具，确保区域特定性。但是在定位深度以及细胞类型特定性上无法确保。而OS则获得细胞类型特定性上的精确性。其他的用于特定神经元元素控制的策略也有如MNP（Magnetic nanoparticles），这种方法主要是把电磁或者辐射频率转化为热能来打开热感通道。

2005年，光遗传技术被提出来并且用于神经科学研究中，到目前为止不过15年。但是这项技术发展迅猛，并且取得了很多成果。总体上看，这项技术的最大特征是在精确时间内对目标细胞进行精确定位。

首先是科学家在一些微生物中发现了一些感光物质蛋白，当它们在细胞内表达的时候，能够产生一些依靠光的激活或者抑制活动。“这些光学的激活的行动调剂器例如HR、ChR和BR还有它们的许多类别已经发展成针对单一成分的和精确时间内对自由移动动物的目标分子群进行控制的工具箱。（德赛若斯，2015）”。^[25]

2015年，一篇名为《光遗传学：神经科学中微生物视蛋白的10年》（optogenetics:10 years of microbial opsins in neuroscience）的文章回顾了光遗传学自2005年以来的10年历史发展。^[26]这篇发表在《自然神经科学》杂志上的文章作者就是光遗传学的发明者斯坦福大学的卡尔·德赛若斯。这篇文章指出了光遗传技术的核心：一种在时空意义上的对细胞信号的精确的因果控制，有助于科学家发现神经系统的功能甚至非神经系统的功能。研究者可以利用这种技术以空前的细节来探究神经系统如何工作的。它有望用于治疗失明、帕金森症以及缓解慢性疼痛。

那么什么是光遗传技术？德赛若斯在《用光控制大脑》（2010）、《光遗传学：神经科学中微生物视蛋白的10年》（2015）等不同时间段的描述，给出了相近定义。在前一篇文献中，他认为光遗传学意味着“把遗传学和光学联合起来，在活体的特定细胞内控制良好的事件。它包括发现已经植入能够传递光反应的基因细胞内，包括把光深入传送到诸如复杂的自由移动的有机体内部的相关技术，还有把敏感光定位到兴趣细胞中，对这种光控制的效果或者特定结果进行评估的技术”。^[27]在后一篇总结性文献中，他采用了2010年的定义。“把遗传方法和光学方法联合起来，在活的组织和行为动物的特定细胞内产生或者抑制良好定义的事件”。^[28]唯一的变化是从学科到方法的描述概念。在这两个定义中，我们可以看到三个方面的重要因素：交叉性、生物体的特定细胞内以及良好定义的事件。交叉性意味着这项技术是两个学科交叉的结果，遗传学与光学，其根本上也是生物学和物理学的交叉；特定细胞内意味着这项技术控制的对象是细胞内的神经元，如脑细胞中的神经元和其他组织体内的细胞物质，因为这项技术的根本目的是通过光来实现对细胞活动在毫秒时空单位内活动的激活或抑制；良好定义的事件意味着某一特殊的行为，这在不同的应用研究中有不同的对象，这也是细胞活动。

关于这一技术发展的来龙去脉的描述亦可参见德赛若斯（2011）的《光遗传学的发展及其应用》（The Development and Application of Optogentics）。^[29]这篇文章应该说是比较权威的文献，后来的参考文献达到了163个，其主要大意是光遗传技术对神经科学产生了明显影响，使得人们在复杂的神经组织内部对被选择的细胞进行模式化。在这一技术的推动下，神经科学获得了新的发展机会。在文章中，德赛若斯等人描述了早期光控制的历史、细菌性光视觉蛋白以及光遗传技术的功能（如神经元激活、神经元抑制、生化控制）。光遗传技术的发展需要其他技术的突破，至少需要以下几种技术：基因技术、光学技术和转基因动物的培养。此外，这一技术的发展得益于转基因动物的发展，尤其是转基因老鼠已经被大量运用到相关实验中。发明者对他们的技术充满了信心，正如其2011年所表达的那样：“光遗传工具的当前一代已经对于更强的表达、更高的电流，以及特定的转向，对同样提及空间内的组合控制非常乐观……在这一时刻，单一成分的光遗传学已经在神经科学实验室中成为主要部分，甚至很多机会还等待开发。”^[30]

图4-4描述了1971年以来“光遗传学”在科学文献中出现的情况，从这张图可以看出，不同的方法对象被提了出来。纵坐标的数字表示2010年10月1日借助光遗传学搜索的文献数量。

图4-4　光遗传技术在文献中出现的情况^[31]

2．光遗传技术的原理(www.xing528.com)

根据高什（2016）的描述，光遗传技术原理是“在毫秒精确单位上使用视蛋白（opsin）对细胞的特定分群进行光控制……最近一些年，视蛋白用来为神经激发或者消除提供一个不同的工具箱，还有细胞信号间的控制”。^[32]但这些专业的描述过于科学化，所以需要加以分解其原理。

光遗传技术的出现是对细胞进行精确控制——激活或者抑制想法的实施。传统有两种刺激方式：药物刺激和电极刺激。药物刺激效果慢而且不准确。电极刺激除了不精确，还有过于粗暴。这些传统的方式都有局限。生物学家克里克的理想是找到“一种方法，能够激活特定类型的神经元，但是不改变其他的神经元”。^[33]光学控制是克里克提出的尝试路径。但是限于当时的技术发展，这只是停留在想象层面。随着光学控制理念的出现，科学家开始寻求对光敏感的物质。

微生物科学家发现自然界有一些微生物能，如细胞、藻类能够产生一些感光性蛋白，即微生物感光蛋白（microbial opsins）。在一些细菌和藻类中有光敏感的蛋白质，在视蛋白DNA中有一些视蛋白工程机理和发动者选择。如果把这些视蛋白DNA打包到病毒载体中，然后注射到大脑中就可以在目标群中诱发视蛋白表达，也就是对某些光产生作用。如果对细胞实体（上部）或者对轴突进行光照（底部）就可以激活细胞或者抑制细胞。但是需要不同视蛋白。

根据科学家的研究发现，视蛋白家族有三个成员：用蓝色光激活的channelrhodopsin（细胞激活）、用黄色光激活的halorhodopsin（细胞抑制）和Bacteriorhodopsin。这三个成员的共同点是对特定光纤极其敏感。从科学史看，这三个成员的出生时间不一。1971年科学家Stoeckenius和Oesterhelt发现了bacteriorhodopsin能够被可见光量子快速激活；1977年Matsuno-Yagi和Mukohata发现了halorhodopsin；2002年Hegemann和Nagel及其团队发现了channelrhodopsin。科学家证明上述三种蛋白质都可以对不同颜色的光产生反应，而这可以使得神经元快速地、安全的关闭或者打开。“多年来几份额外的跟踪报告指出，到2010年，channelrhodopsin、bacteriorhodopsin、halorhodopsin都被证明能够快速而安全地打开或者关闭神经元，即对不同颜色的光产生反应”。^[34]

3．光遗传技术的未来应用

2011年以来，这项技术在全球800多个实验室被使用，中国浙江大学运用这项技术开展了“情感与记忆的神经回路基础”的重大专项课题研究。德赛若斯展望了光遗传技术的未来方向，他指出了三个方向：超越神经科学、扩大工具箱和反转工程。^[35]超越神经科学是指这项技术可以运用到非神经系统上。扩大工具箱是指除了上述两种对蓝光和黄光敏感的蛋白质之外还有对红色光敏感的蛋白质（2008）；但是这还不够远。根据德赛若斯的预见：“光遗传学对人类健康的最基本影响不是来自把视蛋白引入人类组织中，而是来自把它用作获得复杂组织功能洞见的研究工具，如帕金森症。”^[36]不仅如此，甚至可以产生一个新的生物学路径——回路工程路径（circuit-engineering approach）。在这一路径中，各种疾病获得了新的解释：“致命的疾病症状被理解为与特定的神经元群相关的异常神经回路活动的特定时空模式导致的结果。”^[37]如图4-5（见书后彩图）。2015年德赛若斯发表文章描述了这项技术新的进展和运用。“光遗传学方法现在使得人们在一个广泛的问题域中获得洞见，如行为学、生理学和病理学，遍及感觉、认知和行动等领域”。^[38]

在很多应用研究中，将光遗传学运用到记忆研究上取得了明显成效，而且备受瞩目。这一点尤其是MIT走在了前面，在利根川进团队的推动下，记忆的神经机制研究取得了多点突破。光遗传技术的作用是“提供一种挖掘记忆神经过程的细微机制，研究不同脑区、功能联结和神经转化的作用”。通过光遗传技术，逐渐揭示出了海马体对于记忆、非海马体与记忆回路与记忆的神经代码等问题。^[39]为了诱导具体的细胞群中的视蛋白表达，科学家需要做的是将外部的为了视蛋白解码的DNA序列送入大脑。“大多数情况下，这种DNA使用病毒载体（viral vector）注入感兴趣的区域。从几天到几周内，视蛋白通过细胞记忆表达，包括远程的投射。通过在感兴趣的区域上方植入光纤头以及把光纤与光源连载一起来制造照明。”^[40]

2016年他们的视角开始向社会记忆问题转变。^[41]这项研究回应了“记忆存储在哪儿”的这一问题。根据这项研究，“这些细胞，在名为腹部CA1（ventral CA1）海马体区域被找到，它们存储了有助于形成老鼠指向其他老鼠行为的社会记忆”。^[42]

4．光遗传技术的挑战和限制

在高什看来，这项技术存在的问题有四个：侵入性、细胞独特性与内在复杂性、被迫的活动模式与短暂的光照与永久的影响。①侵入性：这一点容易理解，因为要在实验对象脑中植入光纤，这需要在颅内进行病毒注射。“外部蛋白的强烈表达可能对细胞功能产生影响这一点应该通过单独的荧光团表达来加以控制”。更为重要的是与红色有关的视蛋白，则需要光纤位置更加远离兴趣位置。所以这种侵入性难以把握。②细胞独特性与内在复杂性：因为光遗传技术会在实时时间扰乱特定神经群的功能，后来发展起来的实验会带来更复杂的神经回路干扰。③外力的活动模式：由于在细胞激活中，存在一些障碍（被照亮的神经元同时被锁定到特定的频率中），于是这种照料不能提供与实时生命模式很好的相似性。④短暂光照和永久影响：短暂光照会产生怎样的长期影响，这一点科学家并没有太多的知识。仅有少量的研究表明光遗传激活能够独立地改变神经网络。“因此，在实验期间光遗传模式可能会再次模式化被扰乱的神经回路。这个问题无法被避免，但是可以通过比较基础线和照明后的神经活动以及可能的行为来加以控制。”^[43]

上述不同与记忆科学有关的技术之间出现了一种融合，比如光遗传技术与f MRI或者PET等技术的融合。“许多研究已经使用光遗传学来发现和测绘大脑中信息流动的路径，包括分析物理回路联结自身，在其他分析被类型或者使用联结定义的细胞、整合f MRI和PET成像来产生由确定的神经细胞或投射支持的大脑广泛的活动模式地图。”^[44]