乳脂肪球膜的组成与分析研究

乳脂肪球膜是一种独特的生物体系，它的组成和结构是乳脂肪球融合和分泌的结果，主要位于甘油三酯（70%）核心的周围。乳脂肪球膜占总乳脂肪球质量的2%～6%。然而，它的质量主要依赖于乳脂肪球的大小。

乳脂肪球膜由大量的生物活性分子组成，如极性脂、蛋白质、糖蛋白类、胆固醇、酶及其他微量成分。许多关于乳脂肪球（MFG）的组成和结构、工艺、营养和健康性质的研究细节报道已经逐渐出现，表明科学家对乳脂肪球膜日益增长的研究兴趣。蛋白质和极性脂占乳脂肪球膜干重的90%以上，但由于不同研究所使用的分离、纯化和分析技术有较大差异，所以关于乳脂肪球膜组分的结果表达未达成一致，乳脂肪球膜基本组分如表7-1所示。

表7-1 乳脂肪球膜组分的平均含量

注：+表示存在但没有定量；-表示未检出。

乳脂肪球膜是三层膜结构（厚10～50nm）。最里层由蛋白质和极性脂组成，来源于内质网。外层的双层膜来源于哺乳动物乳房上皮细胞的顶端质膜，分泌的时候包裹住了脂肪球体。目前，已经有研究者用物理和化学技术研究了乳脂肪球膜以及分离的膜中蛋白质和极性脂的组成。当前许多关于乳脂肪球膜的结构和分子组成的信息是通过形态学和生物化学的方法得到的。

（一）乳脂肪球膜中的脂质

1. 脂质的组成

乳脂肪球膜的脂质成分是复杂的，主要脂质为极性脂质，同时存在一定的中性脂质，在若干综述中都有详细的介绍。由于小脂肪球具有更大的表面积，因此其乳脂肪球膜中的极性脂质含量也高。

乳脂肪球膜的极性脂质包含磷脂类和神经鞘脂类，二者都是具有疏水尾部和亲水头部的两性分子。磷脂在甘油骨架的sn-1位和sn-2位上酯化两个脂肪酸，磷酸盐残基结合不同的有机基团（如乙醇胺、胆碱、丝氨酸、肌醇）结合在sn-3位上。神经鞘脂类主要是神经鞘磷脂，其特征性结构单位为长链鞘氨基醇，含2～3个羟基基团。鞘氨基醇的氨基与脂肪酸连接后形成神经酰胺，进而通过连接不同有机磷酸酯基团形成鞘磷脂（如连接磷酸胆碱后形成的神经鞘磷脂）或连接糖类后形成糖脂（神经酰胺寡糖苷）。

在所有的哺乳动物中，乳脂肪球膜中主要的极性脂为磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl En-thanolamine，PE）、磷脂酰胆碱（Phosphatidyl Choline，PC）、神经鞘磷脂（Sphingomyelin，SM）、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyl Serine，PS）、磷脂酰肌醇（Phosphatidyl Inositol，PI）。不考虑乳脂肪球的大小，超过20%的极性脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、神经鞘磷脂。近期研究表明，小的乳脂肪球膜中神经鞘磷脂和磷脂酰胆碱的含量比较低，牛的品种、生理、饮食和环境因素都可能影响牛乳中极性脂的含量。

利用二维薄层色谱得到的分析结果显示，乳脂肪球膜中的极性脂质主要包括卵磷脂（PC，35%）、磷脂酰乙醇胺（PE，30%）、神经鞘磷脂（SM，25%）、磷脂酰肌醇（PI，5%）、磷脂酰丝氨酸（PS，3%）和微量中性鞘糖脂、葡糖苷酰鞘氨醇（GluCer）、乳糖酰基鞘氨醇（LacCer）以及神经节苷酯（Gang）。乳脂肪球膜中性脂质的主要成分为甘油三酯，其次是游离脂肪酸、1，2-甘油二酯、1，3-甘油二酯、单甘油酯和胆固醇。此外，还发现了少量溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和溶血卵磷脂（LPC）。

表7-2 牛乳脂肪球膜脂质的组成

乳脂肪球膜极性脂的脂肪酸组成与甘油三酯相比，含有大量的不饱和脂肪酸，尤其是n-6系列和n-3系列的脂肪酸。按不饱和脂肪酸含量由高到低的排序，依次为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸。而磷脂酰胆碱中则多以饱和脂肪酸为主。因此，极性脂的脂肪酸更容易氧化。乳中的磷脂含有丰富的多不饱和脂肪酸[18:1（n-9）、18:2（n-6）、18:3（n-3）]，这些脂肪酸具有较低的熔点，为乳脂肪球膜的流动性发挥重要的作用。磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺中18:1（n-9）等量地分布在sn-1位和sn-2位，而18:2（n-6）主要酯化在sn-2位。在牛乳和人乳的脂肪球膜中，18:0主要位于sn-1位。不同大小乳脂肪球膜中磷脂的脂肪酸组成没有显著的差异。

2. 极性脂质的分布（磷脂双分子层的非均匀分布）

早在1975年，Keena等用磷脂酶A或C分别作用于完整的乳脂肪球，发现磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺是不发生反应的，但是作用于分离提取的乳脂肪球膜却可以发生反应。相反，用磷脂酶作用完整的乳脂肪球或提取的乳脂肪球膜，神经鞘磷脂和磷脂酰胆碱水解的程度相同。证明了乳脂肪球膜和其他红细胞和流感病毒类似，磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂集中在脂双层的外层，而磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸主要位于内层。Deeth等的研究指出磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂和糖脂类大部分分布在膜的外层，而中性脂如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇，主要分布在膜的内层。磷脂的这种不对称分布和其他膜（红血细胞）类似。

（二）乳脂肪球膜中的蛋白质

1. 蛋白质的组成

乳脂肪球膜蛋白质的分泌特点决定了其成分。乳脂肪球膜中的蛋白质含量占乳脂肪球膜量的25%～60%，只占总乳蛋白质的1%～2%，但其来源广泛、功能丰富，可以部分代表泌乳细胞中的蛋白质。芦晶等运用过滤器辅助样品前处理法（FASP）结合纳升液相质谱（NanoLC-MS/MS）测定牛乳乳脂球膜蛋白质的种类和数量，鉴别出了169种蛋白质。根据功能性质对乳脂球膜蛋白质进行分析，其中与免疫及宿主防御反应相关蛋白质占最大比例，其他功能还有信号转导、蛋白质运输、脂类代谢、细胞周期及黏着、蛋白质合成、折叠、修饰、胞膜运输、氧化还原、糖类代谢等。而对乳脂球膜蛋白质的亚细胞定位显示，大多数蛋白质来自于细胞的膜结构，其中细胞顶膜是脂肪球膜的主要来源，也有来自于细胞内部膜结构的蛋白质，包括内质网膜、高尔基体膜、线粒体膜及膜泡结构。

乳脂肪球膜中蛋白质最主要的有8种：其中6种是糖蛋白，包括黏液素1（Mucin1，MUC1）、黄嘌呤氧化还原酶（Xanthine Oxidoreductase，XO/XDH）、黏液素15（Mucin15，MUC15或PASⅢ）、CD36（Cluster of Differentiation 36，PASⅣ）、嗜乳脂蛋白（Butyrophi-lin，BTN）和乳凝聚素（Lactadherin，MFG-E8或PAS6/7）；另外两种都是分子质量更小的非糖基化蛋白质，分别为脂肪分化相关蛋白质（Adipophilin，ADPH）和脂肪酸结合蛋白质（Fatty Acid Binding Protein，FABP）。它们的缩写、分子质量和占泌乳初期牛乳脂肪球膜蛋白质的比例见表7-3。

2. 蛋白质的分布（乳脂肪球膜中蛋白质的非对称分布）

乳脂肪球膜中的蛋白质是不对称分布的，Patton和Trams等通过分析搅拌前后牛乳脂肪球膜释放的各种酶的活性，揭示了所有的5-核苷酸酶分布在膜的外表面，而部分分布于膜内层的核苷酸焦磷酸酶和二价镁离子能够激活腺苷三磷酸酶（ATPase）。事实上，从乳脂肪球膜和鼠肝细胞质膜中都能分离出鞘磷脂和这种酶，表明这两种物质存在于质膜的外表面。(www.xing528.com)

表7-3 牛乳脂肪球膜蛋白质的组成

Mather和Keenan发现了胰蛋白酶催化完整的乳脂肪球和分离的乳脂肪球膜的速率不同，揭示出若干膜蛋白质在分离的膜中比完整的乳脂肪球中更容易得到。

Koen Dewettinck根据已有的文献报道绘制了乳脂肪球膜中主要蛋白质的分布情况。脂肪分化蛋白质（ADPH）对甘油三酯有很高的亲和力，因此分布在极性脂单层膜内部。Van-derghem等通过酶水解乳脂肪球膜结合双向凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDⅠ-TOF-MS）技术，对乳脂肪球膜上的主要蛋白质进行了准确的定位和鉴定，结合最新的研究进展，建立了牛乳脂肪球膜蛋白质的结构模型（图7-1）。新的模型推翻以前嗜乳脂蛋白、脂肪分化相关蛋白质、黄嘌呤氧化还原酶相连或相邻的推测。构建乳脂球膜蛋白质的结构模型对于研究乳脂球膜蛋白质的合成、分泌和功能具有重要意义。

图7-1 乳脂肪球膜蛋白质分布

MUC1：黏液素1；XDH/XO：黄嘌呤氧化还原酶；PASⅢ：黏液素15；CD36：分化抗原簇36；

BTN：嗜乳脂蛋白；ADPH：脂肪分化相关蛋白质；PAS6/7：乳凝聚素；PP3：阮蛋白胨3

（三）乳脂肪球膜的结构

尽管在过去的四十年中做了许多研究，乳脂肪球膜的详细结构依然没有完全明白。近几年，用亲脂性的荧光探针和外源凝集素进行染色处理后，再使用荧光共聚焦显微镜研究原乳中的乳脂肪球膜结构变得十分普遍。Evers等报道了在组成和结构方面，同一物种和物种间的乳脂肪球膜的异质性。Lopez等揭示，磷脂用荧光染料Rh-DOPE染色后，极性脂相分布于乳脂肪球膜平面上，神经鞘磷脂和胆固醇在刚性的液相有序区（Lo）被甘油磷脂的液体基质形成的液态无序区（Ld）所包围。这些结果第一次证明了极性脂非随机的组成。富含神经鞘磷脂的微区，可能源于分泌细胞顶尖质膜的脂筏。共聚焦实验同样揭示蛋白质和糖蛋白在乳脂肪球膜上的不均匀分布，呈补丁或网状结构。迄今为止，荧光探针用于研究乳脂肪球膜，表明神经鞘磷脂区不含有蛋白质和糖蛋白。通过乳脂肪球膜的向温性行为的研究，揭示出在生理学的温度下存在SM区。通过模拟胃肠道消化得知，乳脂肪球的神经鞘磷脂区可能在消化中起作用。

基于生物化学和结构数据的研究，以往乳脂肪球膜的二维示意图主要集中在定位膜蛋白在三层极性脂中的位置。所有的结构都是根据Singer和Nicholson的流动镶嵌模型推测的。近期，Lopez组针对乳脂肪球膜的结构提出一个新的二维模型（图7-2）。第一次表示了这些乳脂肪球膜的结构至少由两种脂相共存于乳脂肪球膜中：流动基质Ld区包含甘油磷脂（PE、PC、PI、PS）、蛋白质、糖蛋白；神经鞘磷脂和胆固醇在Lo区。关于乳脂肪球膜中成分的分子安排依然在胚胎期。不同物种乳脂肪球膜的结构是否有区别依然需要证明，进一步了解乳脂肪球膜结构将会是未来研究的关键。

图7-2 乳脂肪球膜的二维示意图

MFGM：乳脂肪球膜；PC：磷脂酰胆碱；PE：磷脂酰乙醇胺；PS：磷脂酰丝氨酸；PI：磷脂酰肌醇；SM：神经鞘磷脂；ADPH：脂肪分化相关蛋白质；XDH/XO：黄嘌呤氧化还原酶；BTN：嗜乳脂蛋白；MUC1：黏液素1；MUC15：黏液素15；CD36：分化抗原簇36；PAS6/7：乳凝聚素

（四）乳脂肪球膜的生理功能

关于乳脂肪球膜的生理功能有很多研究，表明乳脂肪球膜成分能够带来一定有益健康的影响。

神经鞘磷脂可以对癌症和肠道疾病产生影响。SM通过产生神经酰胺和神经鞘氨醇而促使结肠癌细胞发生生长停滞、分化及细胞凋亡，甚至诱导恶性肿瘤转变为良性。此外SM还参与减少肠壁对胆固醇的吸收。膳食中的神经鞘脂类能够降低血清胆固醇，并保护肝脏免受脂肪、胆固醇诱变的作用。另有研究表明，神经鞘脂类能够通过争夺或充当细胞结合位点，抵抗细菌、病毒感染，进而达到杀菌作用。

乳脂肪球膜蛋白质组分具有抗癌、杀菌等多重作用。膜蛋白中的脂肪酸结合蛋白（FABP）能够在低浓度下抑制乳腺癌细胞生长。有研究报道，经过层析纯化的XDH/XO能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的生长，在胃肠道内发挥抗菌作用。

表7-4和表7-5对乳脂肪球膜中的脂质及蛋白质的营养价值作出了概括性叙述。

表7-4 脂肪球膜极性脂质及其他组分的营养学功能

表7-5 脂肪球膜的主要蛋白质及其组分的功能特性和健康功效

注：EAE为是实验性自身免疫性脑脊髓炎；EAN为实验性过敏神经炎。