常用染色方法在光镜观察中的应用

一、苏木精-伊红（HE）染色

大多数固定液固定的动物组织均可用HE染色，但以Bouin固定液固定的效果最好。可将细胞核和细胞质对比区分开。

染色步骤见第3章第2节实验一的步骤（11）～（18）。

染色结果：细胞核呈蓝紫色，细胞质呈红色（图4-1～图4-4）。

图4-1　人皮肤

图4-2　蟾蜍的气管软骨

图4-3　胭脂鱼眼的纵切

图4-4　胭脂鱼的肾脏

二、番红固绿染色

适用于一般植物组织，特别是分生组织。可将染色质、细胞质、纤维素细胞壁与木质化细胞壁区分开。组织用含有铬酸的固定液固定。

染色步骤：

（1）切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。

（2）染色　用0.01 g/mL的番红水溶液染色1～12 h。

（3）水洗　自来水冲洗，以去除多余染料。

（4）脱水　依次浸入30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇中进行脱水，各5 min。

（5）复染　用0.001 g/mL固绿醇溶液（溶于95%乙醇）复染10～40 s。

（6）继续脱水　用无水乙醇Ⅰ脱水30 s，无水乙醇Ⅱ脱水5 min。

（7）透明　入50%二甲苯2 min，然后浸入100%二甲苯Ⅰ、100%二甲苯Ⅱ中，各10 min。

（8）封藏　用中性树胶封片。

染色结果：染色体或细胞核呈鲜红色，纺锤丝呈绿色，核仁呈鲜红色，纤维素细胞壁呈绿色，木质化细胞壁呈鲜红色，细胞质呈绿色（图4-5，图4-6）。

图4-5　松根横切

图4-6　番茄果肉

三、Jackson结晶紫染色法

适用于显示维管植物的木质组织，可以将木质化和非木质化的细胞壁区分开。一般植物材料的固定液均可用。

染色步骤：

（1）切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。

（2）染色　0.01 g/mL结晶紫水溶液染色15 min，蒸馏水漂洗1次。

（3）脱水　经70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ，各脱水1 min，经无水乙醇Ⅱ脱水5 min。

（4）复染　0.005 g/mL伊红B丁香油饱和溶液复染1～3 min。

（5）透明　浸入50%二甲苯2 min，然后依次浸入100%二甲苯Ⅰ、100%二甲苯Ⅱ中，各10 min。

（6）封藏　用中性树胶封片。

染色结果：非木质化细胞壁呈红色，木质化细胞壁呈紫色。

四、孚尔根染色法

动物和植物组织均适用，专门显示细胞内的脱氧核糖核酸（DNA）。组织用Carnoy液或10%甲醛固定。

染色步骤：

（1）石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。

（2）浸入1　mol/L HCl液（室温）1 min。

（3）浸入1 mol/L HCl液（60 ℃）中水解5～15 min。

（4）浸入1 mol/L HCl液（室温）1 min。

（5）蒸馏水漂洗1次。

（6）Schiff试剂染色1～3 h。

（7）蒸馏水漂洗2次。

（8）脱水　浸入80%乙醇2 min。

（9）复染　0.001 g/mL固绿醇溶液复染1 min。

（10）继续脱水浸入95%乙醇脱水2 min，浸入无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ脱水各5 min。

（11）透明浸入50%二甲苯2min，然后依次浸入100%二甲苯Ⅰ和100%二甲苯Ⅱ中各10 min。

（12）封藏　用中性树胶封片。

染色结果：染色体呈紫红色，染色质呈红色，细胞质与核仁无色（固绿复染后为绿色）。

五、显示糖类物质

1．PAS（过碘酸-Schiff）反应显示糖原

组织用Carnoy液或AF液固定。

注意：除了糖原颗粒以外，黏蛋白、透明质酸、部分网状纤维、纤维蛋白、脑垂体细胞、甲状腺胶样物质、类淀粉以及其他显阳性反应物质均呈不同程度的红色或紫红色。

染色步骤：

（1）切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。

（2）1 mol/L盐酸漂洗3 min。

（3）入0.005 g/mL过碘酸水溶液2～5 min，蒸馏水漂洗。

（4）Schiff试剂浸染15 min（10℃），流水洗10～15 min。

（5）Mayer苏木精复染5 min，水洗。［如不复染，步骤（5）（6）略。］

（6）1%酸水分化，水洗。

（7）梯度乙醇脱水。

（8）二甲苯透明，中性树胶封片。

阴性对照片：用唾液淀粉酶室温消化20 min或用唾液37℃消化10～30 min。不能有空气泡，否则消化不均匀。时间也视组织不同而异。

染色结果：多糖、黏多糖、黏蛋白均显PAS阳性红色（图4-7）。如苏木精复染则细胞核呈蓝色，糖类物质呈红色至紫红色（图4-8）。

图4-7　兔肝糖原

图4-8　胭脂鱼血细胞涂片

2．AB-PAS显示黏多糖

AB-PAS（阿利新蓝-Schiff反应）显示中性和酸性黏液物质效果较好。组织用10%甲醛或中性甲醛固定。

阿利新蓝染色液：阿利新蓝8GS 1 g，蒸馏水97 mL，冰醋酸3 mL。用前过滤，在溶液中加入2粒麝香草酚防腐。

染色步骤：

（1）石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。

（2）蒸馏水洗。

（3）阿利新蓝染色5min。

（4）流水冲洗后入蒸馏水。

（5）入0.01 g/mL过碘酸水溶液5min。

（6）蒸馏水充分水洗，Schiff试剂作用15 min。

（7）流水冲洗25 min。

（8）Mayer苏木精淡染。

（9）流水冲洗。

（10）无水乙醇冲洗及脱水。

（11）二甲苯透明。

（12）中性树胶封片。

染色结果：酸性黏蛋白呈蓝色，中性黏蛋白呈红色，混合黏液显不同程度的紫色，细胞核呈淡蓝色（图4-9，图4-10）。

图4-9　短须裂腹鱼肠后段

图4-10　短须裂腹鱼食道黏膜

六、显示脂类物质

1．苏丹黑B染色法

染色步骤：

（1）组织用甲醛-钙液固定，冷冻切片厚8～10 μm，蒸馏水洗。

（2）Harris苏木精染色液中漂片1 min，自来水洗。

（3）用0.5%盐酸乙醇分色，水洗至细胞核返蓝。

（4）70%乙醇浸洗。

（5）浸入苏丹黑B（或苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ）染色液中染色10～20 min。

（6）用70%乙醇分色3～5 min。

（7）蒸馏水漂洗，捞取切片贴片。

（8）空气干燥后，甘油明胶封片。

染色结果：脂类为黑色，细胞核呈蓝色（图4-11，图4-12）。（苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色时脂类呈橙红色，脂肪酸不着色。）

图4-11　长吻血细胞涂片

图4-12　长吻肾脏印片

2．溴-苏丹黑B染色法

通过溴化作用可使不饱和脂类在有机溶剂中的溶解度变小，增强与苏丹黑B的结合反应，从而显示总脂类。

染色步骤：

（1）组织用甲醛－钙液固定，冷冻切片厚8～10 μm，蒸馏水洗。

（2）浸入2.5%的溴水溶液，室温下作用30 min。

（3）蒸馏水洗。

（4）用0.005 g/mL偏重亚硫酸钠水溶液洗1～2 min，除去多余的溴。

（5）蒸馏水洗。

（6）70%乙醇浸洗。

（7）浸入苏丹黑B（或苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ）染色液中染色10～20 min。

（8）用70%乙醇分色3～5 min。

（9）蒸馏水漂洗，捞取切片贴片。

（10）空气干燥后，甘油明胶封片。

染色结果：甘油三酯、不饱和胆固醇酯均为黑色，某些磷脂呈蓝灰色。

七、显示蛋白质

1．茚三酮－Schiff反应显示氨基

组织或细胞用10%甲醛固定。

偏重亚硫酸钠盐酸溶液：10%偏重亚硫酸钠5 mL，1 mol/L盐酸5 mL，蒸馏水90 mL。

染色步骤：

（1）切片脱蜡至水或新鲜冷冻切片入水。

（2）70%乙醇中浸泡5 min。

（3）用0.005 g/mL茚三酮溶液在37℃处理12～24 h。

（4）流水冲洗5 min。

（5）在Schiff试剂中染色15～30 min。

（6）用偏重亚硫酸钠盐酸溶液冲洗3次，每次2 min。

（7）流水冲洗10 min。

（8）Mayer苏木精复染，再水洗。

（9）常规脱水、透明和封片。

染色结果：蛋白质的α-氨基呈粉红至紫红色，核呈浅蓝色。

2．过甲酸－阿利新蓝法显示S-S键

过甲酸液：98%甲酸40 mL，双氧水4 mL，浓硫酸0.5 mL。

阿利新蓝染色液：阿利新蓝1 g，蒸馏水47 mL，浓硫酸2.7 mL。

染色步骤：

（1）切片脱蜡至水，或新鲜冷冻切片入水，吸去多余水分。

（2）置于新配制的过甲酸液中处理5 min。

（3）蒸馏水洗3次，每次3 min。

（4）切片置于60℃的烘箱中干燥，使切片贴得更牢。

（5）流水充分水洗。

（6）阿利新蓝染色60 min。

（7）流水充分水洗5 min。

（8）用中性红复染。

（9）常规脱水、透明和封片。

染色结果：含S-S键的蛋白质呈蓝色（颜色深浅跟S-S键的含量有关）。

八、显示酶类

1．偶氮偶联法显示酸性磷酸酶

显示酸性磷酸酶的方法主要是金属沉淀法和偶氮偶联法。金属沉淀法把握不好容易出现假阳性；而偶氮偶联法是利用在酸性条件下（最适pH 5.0～5.1）酸性磷酸酶水解底物萘酚AS-TR磷酸盐产生游离的萘酚AS-TR和磷酸，萘酚AS-TR与重氮盐六偶氮对品红偶联，形成红色不溶性复合物，沉淀在酶活性部位而显示出来。由于正常生物组织内不存在萘酚，因此该法不会出现假阳性。

丙酮固定液：丙酮60 mL，30 mmol/L冰醋酸40 mL，甲醇11 mL，用NaOH调pH至5.4。

孵育液：萘酚AS-TR磷酸盐10 mg，二甲基亚砜1 mL，0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH7.6）30 mL，六偶氮对品红1 mL，用2 mol/L HCl调pH至5.0 ～ 5.1。若孵育液出现沉淀即失效。

六偶氮对品红溶液：A液—盐酸对品红400 mg，蒸馏水8 mL，浓盐酸2 mL；B液—NaNO2 4 g，蒸馏水100 mL；临用前将A、B液等体积混合。

染色步骤：

（1）对小块新鲜组织冷冻切片，用4℃丙酮固定液固定15 min。

（2）用0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH7.6）漂洗。

（3）孵育液37℃孵育2 h，轻摇。

（4）37℃蒸馏水漂洗2次。

（5）用0.01 g/mL甲基绿水溶液复染或Mayer苏木精染液复染2～5 min。

（6）蒸馏水洗，室温晾干。

（7）甘油明胶封片，镜检。(www.xing528.com)

阴性对照：①切片孵育前90 ℃加热10 min，②孵育液中加入氟化钠（1.5 mg/mL）。

染色结果：细胞核染呈绿色（甲基绿复染）或蓝色（苏木精复染），酸性磷酸酶活性处呈红色颗粒状或弥散状分布（图4-13）。

图4-13　胭脂鱼外周血涂片

2．偶氮偶联法显示碱性磷酸酶

原理同显示酸性磷酸酶的偶氮偶联法相似，该法不易出现假阳性。

孵育液：萘酚AS-BI磷酸钠10～25 mg，二甲基亚砜0.5 mL，0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2～9.2）50 mL，坚牢红TR 50 mg。

染色步骤：

（1）对小块新鲜组织冷冻切片，用4℃甲醛-钙液固定10 min，蒸馏水洗。

（2）用0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2～9.2）漂洗。

（3）用孵育液在37℃或室温孵育5 ～ 60 min，蒸馏水洗。

（4）用4%甲醛固定15 min ～ 2 h。

（5）流水冲洗，蒸馏水漂洗。

（6）用0.01 g/mL甲基绿复染5～10 min，蒸馏水洗。

（7）甘油明胶封片。

染色结果：酶活性处呈现红色无定型沉淀，核呈蓝绿色。

3．二氨基联苯胺法显示过氧化物酶（Peroxidase）

25%戊二醛12 mL，60%丙酮水溶液88 mL；4℃保存。

孵育液：3, 3’-diaminobenzidine（DAB）10 mg，0.05 mol/L Tris-HCl（pH7.6）40 mL，3%H2O2 0.13 mL；用力振荡混合2～3 min，过滤后使用。

染色步骤：

（1）对小块新鲜组织冷冻切片，用4℃戊二醛－丙酮溶液（或甲醛-钙液）固定10 min，蒸馏水洗。

（2）用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.6）漂洗。

（3）入孵育液，37℃，孵育10 min，轻摇。

（4）蒸馏水漂洗，2次。

（5）Mayer苏木精溶液复染5 min。

（6）常规脱水、透明、中性树胶封片。

对照：①孵育前90℃加热10 min，②用不含H2O2的孵育液孵育，③用含较高浓度H2O2（30%H2O2 0.25 mL）的孵育液孵育，④用含高浓度H2O2（30%H2O2 1.5 mL）的孵育液孵育。

染色结果：过氧化物酶活性部位呈棕褐色（图4-14，图4-15）。

图4-14　长吻外周血涂片

图4-15　长吻头肾印片

4．萘酯六偶氮品红法显示非特异性酯酶

2.5%戊二醛：50%戊二醛溶液5 mL，ddH2O 45 mL，0.2 mol/L PBS 50 mL；4℃保存。

孵育液：醋酸-α-萘酚10 mg，丙酮0.4 mL， PBS（pH5.0）40 mL，六偶氮对品红溶液2.4 mL；充分混合后调pH至5.8，过滤。

六偶氮对品红溶液：A液——盐酸对品红400 mg，蒸馏水8 mL，浓盐酸2 mL；B液——NaNO2 4 g，蒸馏水100 mL；临用前将A、B液等体积混合。

染色步骤：

（1）对小块新鲜组织冷冻切片，用4℃戊二醛－丙酮溶液（或甲醛-钙液）固定10 min，蒸馏水洗。

（2）蒸馏水洗30 s，冷风吹干。

（3）入孵育液，37℃孵育。每15 min换液1次，共换3次。

（4）37℃蒸馏水洗2 min。

（5）甲基绿复染10 min，蒸馏水冲洗。

（6）无水乙醇脱水（快速）。

（7）二甲苯透明。

（8）中性树胶封片。

对照：（1）孵育前90℃加热10 min，（2）用不含底物的孵育液孵育，（3）孵育液中加入NaF（1.5 mg/mL）。

染色结果：核呈绿色，酸性醋酸-α-萘酯酯酶（ANAE）活性部位呈现红棕色至深棕色（图4-16，图4-17）。

图4-16　长吻血细胞涂片

图4-17　长吻头肾印片

九、显示结缔组织

1．Cason三色染色法（Mallory一步三色法）

用10%甲醛溶液、乙醇及其他固定液固定的组织均可，但以Zenker、Helly等含汞固定液效果最佳。

染色步骤：

（1）切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。

（2）蒸馏水洗。常规甲醛固定的组织不易着色，须在切片染色前用重铬酸钾－醋酸液（重铬酸钾2.5 g、醋酸5 mL、蒸馏水95 mL）媒染1 h以上。

（3）Cason三色染液染色5～15 min，蒸馏水洗2次。

（4）95%乙醇迅速分化至胞核呈深红色，胶原纤维呈蓝色。

（5）100%乙醇迅速脱水2 min。

（6）二甲苯透明，中性树胶封片。

染色结果：胶原纤维、网状纤维、黏液呈深蓝色，肌纤维呈橘黄色或橘红色，红细胞呈橘黄色，细胞核呈深红色（图4-18，图4-19）。

图4-18　长吻的颈动脉膨大

图4-19　胭脂鱼的心肌

2．醛品红法显示弹性纤维

一般用10%甲醛液、甲醛－乙醇液或Bouin液固定，常规石蜡包埋。

橘黄G染液：橘黄G 2 g，蒸馏水100 mL，磷钨酸5 g。

染色步骤：

（1）切片二甲苯脱蜡至水。

（2）蒸馏水洗。

（3）浸入0.005 g/mL的高锰酸钾溶液处理1～2 min。

（4）流水漂洗。

（5）用0.01 g/mL草酸漂白1 min，水洗1 min。

（6）浸入50%乙醇液中1～2 min。

（7）浸入醛品红染液中染色5～15 min。

（8）蒸馏水迅速漂洗，浸入95%乙醇中分色，分色时间以背景无色为止。

（9）浸入蒸馏水30～60 s。

（10）以橘黄G染液染色1 s，蒸馏水迅速洗涤。

（11）乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

染色结果：弹性纤维呈紫色，胶原纤维呈红色，平滑肌呈黄色（图4-20）。

图4-20　兔皮下结缔组织

十、显示肌组织

1．磷钨酸苏木精法

染色步骤：

（1）石蜡切片脱蜡至水。若经含汞固定液固定的组织，须用0.005 g/mL碘酒溶液脱汞，再用0.05 g/mL的硫代硫酸钠脱碘。

（2）蒸馏水浸洗2 min。

（3）0.002 5 g/mL的高锰酸钾水溶液氧化2～3 min。

（4）蒸馏水浸洗2 min。

（5）用0.005 g/mL的草酸水溶液漂白2～3 min。

（6）蒸馏水浸洗3～4次。

（7）0.04 g/mL铁矾水溶液媒染1 h。

（8）流水冲洗，蒸馏水漂洗。

（9）磷钨酸苏木精染色6～12 h。

（10）用95%的乙醇迅速分色并脱水。

（11）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

染色结果：横纹肌横纹，平滑肌核、胞浆等呈不同深浅的蓝色，横纹显示清晰。

2．碘酸钠－苏木精块染法

此法可显示心肌润盘。

硝酸乙醇固定液：无水乙醇80 mL，蒸馏水16 mL，浓硝酸4 mL。

染色步骤：

（1）取1～2 mm厚的小块心肌组织，在硝酸乙醇固定液中固定24 h。

（2）入70%和50%的乙醇各4 h，摇匀。

（3）蒸馏水漂洗。

（4）放入碘酸钠-苏木精染液中染色10～15 d，其间经常摇动使浸染均匀。

（5）流水冲洗24 h。

（6）常规脱水、透明、石蜡包埋和切片。

（7）烘干后的切片经二甲苯脱蜡后，中性树胶封片。

染色结果：心肌润盘呈蓝黑色（图4-21）。

图4-21　心肌

十一、显示神经组织

1．Golgi镀银染色法

染色步骤：

（1）取厚度小于10 mm的新鲜脑组织浸入10%甲醛液中固定24～48 h。

（2）蒸馏水洗，0.03 g/mL重铬酸钾水溶液内37℃媒染3 d，每天换新液体1次。

（3）蒸馏水洗1～2 min。

（4）置于0.007 5 g/mL硝酸银水溶液中，37℃浸染2～3 d。

（5）蒸馏水洗5～10 min。

（6）可直接冷冻切片，也可逐级乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚20～100 μm。

（7）二甲苯脱蜡、透明，合成树脂或中性树胶封片。

染色结果：神经元胞体、突起及神经胶质细胞呈棕黑色（图4-22，图4-23）。

图4-22　兔大脑皮层

图4-23　兔大脑皮层锥体细胞

2．周围神经锇酸染色法

染色步骤：

（1）小块新鲜组织厚度不超过3 mm，固定于1%锇酸水溶液中24～48 h。

（2）流水冲洗12 h。

（3）常规石蜡包埋，切片厚8～10 μm。

（4）常规贴片、脱蜡、透明和封片。

染色结果：髓鞘黑色，非饱和脂类呈棕褐色（图4-24，图4-25）。

图4-24　有髓神经纤维横切

图4-25　有髓神经纤维纵切

3．硫堇染色法显示尼氏体

尼氏体为神经细胞所特有，取材必须新鲜，因机体死亡后尼氏体会很快溶解，分散，不易着色。

新鲜组织用10%中性甲醛或95%乙醇固定，石蜡切片厚6～10 μm。

染色步骤：

（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）蒸馏水洗1～2 min。

（3）用0.02　g/mL的硫堇水溶液于50～60℃温箱内浸染30～60 min。

（4）蒸馏水洗1～2 min。

（5）用95%乙醇迅速分化。

（6）无水乙醇脱水8～10 min，二甲苯透明8～10 min，中性树胶封片。

染色结果：尼氏体及核仁深蓝色，细胞核淡蓝色（图4-26，图4-27）。

图4-26　贝氏高原鳅脊髓横切

图4-27　贝氏高原鳅小脑

4．Scott改变法显示神经胶质细胞

组织用10%中性福尔马林液固定。冷冻切片20～25 μm；石蜡切片15～25 μm。

染色步骤：

（1）石蜡切片常规脱蜡至水。冷冻切片染色前需在10%氨水内预作用2 h。

（2）蒸馏水充分水洗。

（3）切片入氨银液镀银3～4 s。（以2 mL浓氨液逐滴加入到5%硝酸银水溶液中，至液体呈黄褐色略浑浊为止。）

（4）切片转入3%甲醛中作用30 s，并不断摇动。

（5）蒸馏水充分漂洗。

（6）浸入0.05 g/mL硫代硫酸钠水溶液内作用2～5 min。

（7）蒸馏水充分漂洗。

（8）常规脱水，透明，中性树胶封片。

染色结果：神经胶质细胞被染成黑色，其他结构呈灰色（图4-28，图4-29）。

图4-28　贝氏高原鳅延脑迷叶

图4-29　贝氏高原鳅延脑面叶