（一）用具与药品
冷冻切片机、温箱、染色缸、载玻片、盖玻片、镊子、毛笔、铬矾明胶、多聚赖氨酸或胶水、中性甲醛固定液、甲醛-钙固定液、苏丹黑B染色液、Mayer苏木精染色液、1%伊红染色液、乙醇、二甲苯、树胶、甘油明胶等。
（二）材料
动物新鲜性腺组织或已固定的组织。
（三）操作步骤（以Leica冷冻切片机为例）
（1）取材 一般将新鲜组织切成宽10 mm，厚3～5 mm的组织块，取材修整后的组织块可不加任何处理直接进行冷冻切片，也可以将材料放入冷冻切片包埋剂（多聚赖氨酸或常规胶水）中经液氮速冻后形成速冻包埋块置于-80 ℃冰箱中保存备用，或经固定液固定后置于70%乙醇中保存备用。
（2）切片、染色与封藏 新鲜组织和速冻组织的切片及后续处理过程相同，与经过固定的组织不同。冷冻切片机需在切片前2 h将温度调至切片温度-20 ℃。
①新鲜组织和速冻组织（以鱼卵巢为例，显示脂类物质）。
1）平衡温度 经液氮速冻的组织从-80 ℃冰箱取出后置于-20 ℃冰箱中平衡温度，新鲜组织放入包埋剂中置于冷冻切片机的速冻台上速冻至-20 ℃。方法如下：将适量胶水或多聚赖氨酸滴在金属盘（即组织固定台）上，然后将新鲜材料放到胶水上面轻轻按下至胶水将材料全部浸没，再将金属盘及材料一起放到速冻台上速冻10 min，使金属盘及材料牢固粘在一起。当速冻包埋块的温度平衡至-20 ℃后，用少量胶水将其固定于金属盘上。
2）切片 调整好冷冻切片机，将带有材料的金属盘固定于冷冻切片机的材料推进器上，开始切片。切片厚度8～10 μm。
3）贴片 利用载玻片吸附法贴片，即用均匀涂有铬矾明胶的载玻片的涂胶面向下轻轻接触材料切片，由于切片温度较低（-20 ℃）而载玻片温度较高（室温），一经接触，材料立即粘到玻片上。
4）干燥 将切片在室温空气中放置5 min，使其自然晾干，粘贴牢固。
5）固定 将晾干的切片放入甲醛-钙固定液中固定10 min。
6）漂洗 蒸馏水漂洗2次，换70%乙醇漂洗1次。
7）染色 用苏丹黑B染色液染色10 min。
8）分色 用70%乙醇分色5～10 s，然后水洗。
9）复染 如需要可用1%伊红染色液复染。
10）封片 水洗后，用甘油明胶封片。
染色结果：脂类物质（油滴）呈蓝黑色（图3-9）。(www.xing528.com)
②固定的组织（以蟾蜍卵巢为例，HE染色）。
1）组织充分水洗24 h，除去组织中的固定液。
2）浸入12.5%明胶溶液（以1%石炭酸水溶液配制），37 ℃温箱中浸24 h。
3）移入25%明胶溶液内浸24 h。
4）入10%甲醛内固定明胶块1～2 d，水洗。
5）切片、贴片、干燥与漂洗方法同（1）新鲜组织和速冻组织。
6）染色 用Mayer苏木精染色5～15 min，自来水漂洗。
7）复染 用伊红染色液复染1 min。
图3-9 鳜鱼卵
图3-10 蟾蜍的卵巢
8）脱水、透明与封片 如果染液为水溶性的，染色水洗后直接用水溶性封片剂（如甘油明胶）封片。如果染液是醇溶性的，染色水洗后可用水溶性封片剂封片，也可以常规乙醇脱水，二甲苯透明后用树胶封片。
染色结果：同常规石蜡切片（图3-10）。
（四）思考题
新鲜组织和速冻组织与经固定液固定的组织在进行冷冻切片时步骤上有哪些异同？
（五）实验报告
1．你的实验结果（贴图）
2．实验总结（心得与体会）
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