动物组织石蜡切片实验优化指南

（一）用具与药品

旋转切片机、展片台、石蜡、烘箱、染缸、单面刀片、解剖刀、眼科镊、培养皿、毛笔、吸水纸、载玻片、盖玻片、生理盐水、Bouin固定液、Carnoy固定液、各浓度乙醇、Ehrich苏木精染色液、0.01 g/mL伊红乙醇溶液、高碘酸水溶液、1%酸水、0.001 g/mL碱水、二甲苯、中性树胶等。

（二）材料

动物肝脏或心脏、胃、肠、肾脏及血管等组织。

（三）操作步骤

（1）取材　将动物麻醉后立即剖开其胸腔或腹腔，取下所需部分，如肠、心脏或肝脏，放入盛生理盐水的培养皿中洗去表面血迹，然后吸去多余水分，修整（0.2 cm×0.2 cm×0.5 cm）后投入固定液中。

（2）固定　材料切好后，应立即投入盛有固定液的固定瓶中。Bouin液固定24 h，或Carnoy固定液固定4 h。

（3）冲洗　Bouin液固定完毕后水洗或不经水洗直接放入70%乙醇开始脱水程序或长期保存。Carnoy固定液固定后可直接放入90%乙醇开始脱水程序或下行复水至70%乙醇长期保存。（乙醇浓度逐渐降低，水分含量逐渐升高的过程叫下行复水。）

（4）脱水　依次浸入70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中进行脱水，各10 min。

（5）透明　依次浸入50%二甲苯、100%二甲苯Ⅰ、100%二甲苯Ⅱ中进行透明，各30 min。

（6）浸蜡　将已透明的材料依次浸入60 ℃的50%石蜡（即等体积二甲苯和石蜡的混合物）、纯石蜡Ⅰ、纯石蜡Ⅱ中，各30 min～1 h。

（7）包埋　准备包埋盒，折纸盒须用较硬而光滑的纸，纸盒大小可根据材料的大小及多少而定。包埋时先把包埋盒内盛满60 ℃纯石蜡，然后将材料移入盒内，根据切片需要调整好位置（称“定位”）后，置冷冻台上或预先准备好的冷水中使其凝固。待石蜡块内外完全凝固后即可切片。

（8）切片　厚度一般为5～8 μm。

（9）展片　在干净载玻片上均匀涂一薄层蛋白甘油，然后在涂层上滴数滴蒸馏水，用刀片事先将蜡带分割成小段，并正面朝上漂浮在水滴上，然后把玻片放在展片台上，使温度保持在50 ℃左右。因蜡带受热而膨胀对材料产生一定的拉力而展开，及时调整蜡带的位置使其美观。待切片完全展平后，吸去多余水分。

（10）干燥　置于37 ℃温箱中干燥24 h，备用。

通常步骤（11）～（18）是一次性完成的，中间不间断。所以通常所说的染色方法包括了脱蜡、复水、染色、透明与封藏等过程。

（11）脱蜡　将烘干的切片放入染色架，分别置于100%二甲苯Ⅰ和100%二甲苯Ⅱ中各30 min以脱蜡。

（12）复水　将脱蜡后的切片依次浸入50%二甲苯、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇中各2 min，最后微流水冲洗1 min即可。

（13）染色　苏木精染色5～15 min，自来水漂洗。

（14）分色　1%酸水分化30 s，漂洗2次。（根据实际情况此步可省略。）(www.xing528.com)

（15）中和　0.1%碱水中和30 s，自来水冲洗30 min使其返蓝。（不分色则此步省略。）

（16）脱水与复染　将切片依次浸入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ中，各5 min进行脱水，然后浸入伊红乙醇液复染30 s～1 min，再依次浸入95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中继续脱水，各5 min。

（17）透明　依次浸入50%二甲苯、100%二甲苯Ⅰ、100%二甲苯Ⅱ中，各10　min。

（18）封藏　用中性树胶封片。

以上是常规苏木精-伊红染色（HE）染色步骤，染色过程中要注意：

（1）苏木精染色的时间要根据染液的已使用时间和染色时的温度而定。染液使用越久，着色能力越差，温度越低，染色时间越长。

（2）用碱水中和后的水洗时间较长，是为了充分洗掉氨水和浮色，并使酸化的苏木精充分返蓝，使制好的切片标本长期保存不变色。

（3）0.01 g/mL伊红染液（醇溶）染色时要把握好时间，时间太长会导致着色过红而影响观察。可用0.002～0.005 g/mL的伊红代替，并适当延长时间。

图3-1　蟾蜍肠横切

图3-2　蟾蜍的骨骼肌

染色结果：细胞核呈深蓝色，细胞质呈红色（图3-1，图3-2）。

（四）思考题

1.综合运用所学知识，阐述切片时组织材料破碎的原因。

2.阐述切片过程中蜡片不能连续成带的原因及解决办法。

3.为什么染色过程中切片脱水的时间要比复水的时间长？

（五）实验报告

1．你的实验结果（贴图）

2．实验总结（心得与体会）