维生素C测定：2，4-二硝基苯肼比色法

维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。

维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性，进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。在食品中这三种形式均有存在，但主要是前两者，因此许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。

测定维生素C的方法有2，6-二氯靛酚滴定法、2，4-二硝基苯肼比色法、荧光法及高效液相色谱法。2，6-二氯靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其他还原性物质（如Fe2+、Sn2+、Cu2+等）会干扰测定，使测定值偏高，对深色样液滴定终点不易辨别。2，4-二硝基苯肼比色法和荧光法测得的是抗坏血酸和脱氧抗坏血酸的总量。高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的方法。

1.原理

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，在520nm处进行比色定量。

2.试剂

（1）4.5mol/LH2SO4。谨慎地加250mL，硫酸（相对密度1.84）于700mL水中，冷却后用水稀释1000mL。

（2）硫酸（9+1）。谨慎地加900mL硫酸（相对密度1.84）于100mL水中。

（3）20g/L2，4-二硝基苯肼溶液。溶解2.0g2，4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸溶液内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。

（4）20g/L草酸溶液。溶解20g草酸（H2C2O4）于700mL水中，稀释至1000mL。

（5）10g/L草酸溶液。稀释500mL20g/L草酸溶液到1000mL。

（6）10g/L硫脲溶液。溶解5g硫脲于500mL10g/L草酸溶液中。

（7）20g/L硫脲溶液。溶解10g硫脲于500mL10g/L草酸溶液中。

（8）1mol/LHCl取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。

（9）抗坏血酸标准溶液。溶解100mg纯抗坏血酸于100mL10g/L草酸中，配成每毫升相当于1mg抗坏血酸。

（10）活性炭。将100g活性炭加到750mL，1mol/L盐酸中回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止后置于110℃烘箱中烘干。

检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2g/L亚铁氰化钾与盐酸（1+99）等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。

3.仪器和设备

恒温箱（37±0.5）℃、可见紫外分光光度计、组织捣碎机。

4.操作步骤

（1）样品的制备。

①鲜样的制备。称100g鲜样和100mL20g/L草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆（含1～2mg抗坏血酸）倒入100mL容量瓶中，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。

②干样制备。称1～4g干样（含1～2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入10g/L草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，混匀。

将①和②液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。

（2）氧化处理。取25mL，上述滤液，加入2g活性炭振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL此氧化提取液加入10mL20g/L硫脲溶液，混匀。(www.xing528.com)

（3）呈色反应。

①于三个试管中各加入4mL经氧化的样品稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0mL20g/L2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（370±5）℃恒温箱或水浴中，保温3h。

②3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温。然后加入1.0mL20g/L2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤同样品。

（4）硫酸（9+1）处理。当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL硫酸（9+1），滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。

（5）比色。用1cm比色皿，以空白液调零点，于520nm波长测吸光度值。

（6）标准曲线绘制。

①加2g活性炭于50mL标准溶液中，摇动1min，过滤。

②取10mL滤液放入500mL容量瓶中，加5.0g硫脲，用10g/L草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度为20μg/mL。

③取5mL、10mL、20mL、25mL、40mL、50mL、60mL稀释液，分别放入7个100mL容量瓶中，用10g/L硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1μg/L、2μg/L、4μg/L、6μg/L、8μg/L、10μg/L、12μg/L。

④按样品测定步骤形成脎并比色。

⑤以吸光度值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

5.计算

式中：x——总抗坏血酸含量，mg/100g；

c——由标准曲线查得或由回归方程算得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，μg/mL；

V——试样用10g/L草酸溶液定容的体积，mL；

F——样品氧化处理过程中的稀释倍数；

m——试样质量。

6.说明及注意事项

（1）本法为国家标准方法，适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。

（2）活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低；加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。

（3）硫脲可防止抗坏血酸继续氧化，同时促进脎的形成。最后溶液中硫脲的浓度要一致，否则影响测定结果。

（4）试管从冰浴中取出后，因糖类的存在造成显色不稳定，颜色会逐渐加深，30s后影响将减小，故在加入85%硫酸后0.5min准时比色。

（5）测定波长一般为495～540nm，样品杂质多时在540nm较合适，但灵敏度较最大吸收波长（520nm）下的灵敏度降低30%。