使用比色法测定维生素E含量

食品中维生素E的测定方法有比色法、荧光法、气相色谱法和液相色谱法。比色法操作简单，灵敏度较高，但对维生素E没有特异的反应，需要采取一些方法消除干扰。荧光法特异性强、干扰少，灵敏、快速、简便。高效液相色谱法具有简便、分辨率高等优点，可在短时间内完成同系物的分离定量，是目前测定维生素E最好的分析方法。

1.原理

维生素E能将高价铁离子还原为低价铁离子，低价铁离子与α，α′-联氮苯发生颜色反应，可以进行比色测定。

2.试剂

（1）乙醚。同比色法测定维生素A中试剂（3）。

（2）甲醇。

（3）无水乙醇。同比色法测定维生素A中试剂（4）。

（4）20g/L氢氧化钾溶液。

（5）2mol/L氢氧化钾甲醇溶液。

（6）0.5%α，α′-联吡啶无水乙醇溶液。

（7）0.2%三氯化铁无水乙醇溶液。新鲜配制。

（8）吸附剂FloridinXS。在50g吸附剂中加入100mL盐酸，置沸水浴上1h，放置室温，倾出酸液。再加入100mL盐酸，搅拌均匀，30min后将酸弃去，用水洗至中性。然后，用乙醇和苯相继洗涤，在室温下晾干备用。

（9）维生素E标准溶液。α-生育酚（298nm）、γ-生育酚（294nm）、δ-生育酚（298nm），纯度皆为95%。用乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mg/mL。临用前以紫外分光光度法分别标定其准确浓度。用无水乙醇稀释成浓度为5μg/mL的标准使用液。

3.操作步骤(www.xing528.com)

（1）样品处理。

①皂化。取1g脂肪提取液于脂肪瓶中，加入2mL2mol/L氢氧化钾甲醇溶液。连接回流冷凝管，在氮气流中于72℃～74℃温度下皂化数分钟。皂化液用8mL甲醇稀释，并移入分液漏斗中，加10mL水。后用乙醚萃取3次，每次30～50mL合并乙醚液，用200mL水分3次洗涤，再用2%氢氧化钾洗涤一次，最后用水洗至中性。将乙醚提取液经过无水硫酸钠柱子或漏斗脱水，在二氧化碳气流中，减压蒸发至干，遂用5mL，苯溶解。

②纯化。取处理好的吸附剂装满12mm～30cm的分离柱，用苯润湿。将上述样液倾入柱中，用苯淋洗至洗出液容积为25mL。若柱层上出现微蓝绿色带，为类胡萝卜素；出现暗蓝色带，为维生素A。如果没有类胡萝卜素存在，可直接用25mL苯溶解残渣。

（2）样品测定。取适量样液（1～2mL，）于25mL比色管中。加入0.2%三氯化铁乙醇溶液1mL，摇匀。加0.5%α，α′-联吡啶的乙醇溶液1mL，用无水乙醇定容。摇匀，放置10min后于520nm波长处读取吸光度值，同时做空白试验。

（3）标准曲线的绘制。根据样液浓度，分别吸取一定量的维生素E标准使用液配制成标准系列，按样品测定步骤读取吸光度值，绘制标准曲线。

4.计算结果

同维生素A的测定。1国际单位维生素E相当于1.1mgα-维生素E。

5.说明及注意事项

（1）维生素E在碱性条件下与空气接触易被氧化，因此在皂化时，用氮气流保护，也可加入焦性没食子酸作为抗氧化剂，防止维生素E的氧化。

（2）此方法的反应没有特异性，当有其他还原性物质存在时，同样能与Fe3+反应生成Fe2+，使测定结果偏高，故处理前应将它们除去。

（3）也可采用4，7-二苯基-1，10-菲啰啉作为发色剂，其灵敏度比α，α′-联吡啶高2.4倍。

（4）维生素E的各种异构体与实际的反应速度、呈色强度各不相同，如δ-维生素E的显色强度比α-维生素E强30%。当样品中的维生素E主要是α-维生素E，其他异构体含量很少时，此法测得的总维生素E量与真值相近，若样品中α-维生素E少，而其他异构体含量较多时，用本法测定结果与真值往往有差异。特别是会有大量α-维生素E时，测得值比真值偏高。

（5）由于光能促进维生素E氧化，因此应尽可能避光操作。