维生素D的测定方法：三氯化锑比色法（AOAC法）

1.原理

在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与维生素D的含量成正比。

2.试剂

（1）250g/L三氯化锑-三氯甲烷溶液。将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100mL三氯甲烷的棕色试剂瓶中，振摇，使之溶解，再加入无水硫酸钠10g，用时吸取上层清液。

（2）三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液。在试剂（1）中加入为其体积3%的乙酰氯，摇匀。

（3）无水乙醚。同比色法测定维生素A试剂中（3）。

（4）无水乙醇。同比色法测定维生素A试剂中（4）。

（5）石油醚（沸程30℃～60℃）。

（6）维生素D标准溶液。称取0.25g维生素D，用三氯甲烷稀释至100mL，此液浓度为2.5mg/mL，临用时以三氯甲烷配制成0.025～2.5μg/mL的标准使用液。

（7）聚乙二醇（PEG）600。

（8）白色硅藻土Celite 545（柱层析载体）。

（9）氨水。

（10）无水硫酸钠。

（11）0.5mol/L氢氧化钾溶液。

（12）中性氧化铝。层析用，100～200目。在550℃灰化炉中活化5.5h，降温至300℃左右取出后装瓶。冷却后，每100g氧化铝加入4mL水，用力振摇，使无块状，瓶口封紧储存于干燥器内，16h后使用。

3.操作步骤

（1）样品处理。皂化与提取步骤同维生素A的测定。如果样品中有维生素A共存，可用以下方法进行分离纯化。

①分离柱的制备。取一支内径为2.2cm，具有活塞和砂芯板的玻璃层析柱。

第一层：加入1～2g无水硫酸钠，铺平整。

第二层：称取15g Celite545置于250mL碘量瓶中，加入80mL，石油醚，振摇2min，再加入10mL，聚乙二醇600，剧烈振摇10min，使其黏合均匀，然后倾入层析柱内。

第三层：加5g中性氧化铝。(www.xing528.com)

第四层：加入2～4g无水硫酸钠。

轻轻地转动层析柱，使第二层的高度保持在12cm左右。如图5-15。

图5-15　层析装置

②纯化。先用30～50mL石油醚淋洗分离柱，然后将样品提取液倒入柱内，再用石油醚继续淋洗。弃去10mL最初收集的滤液，再用200mL容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度保持在2～3mL/min。

将淋洗液移入500mL分液漏斗中，每次加100～150mL水，洗涤3次（去除残留的聚乙二醇，以免与三氯化锑作用形成浑浊物，影响比色）。

将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器中减压浓缩至干或在水浴上用水泵减压抽干，立即加入5mL三氯甲烷溶解备用。

（2）测定。

①埋准曲线的绘制。准确吸取维生素D标准使用液（浓度视样品中维生素D含量高低而定）0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL比色管中，用三氯甲烷定容。取上述标准比色液各1mL于1cm比色杯中，立即加入三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液3mL，在500nm波长下，于2min内测定吸光度，绘制标准曲线。

②样品测定。吸取样品纯化液1mL于1cm比色皿中，按标准曲线的绘制操作，于500nm处测吸光度，以标准曲线定量。

4.结果计算

根据样品溶液的吸光度值标准曲线上查出相应的含量，然后按下式计算。

式中：x——样品中维生素D的含量，mg/100g；

c——标准曲线上查得样品溶液中维生素D的含量，μg/mL；（如按国际单位，每国际单位=0.025μg维生素D）；

V——样品提取后用三氯甲烷定容的体积，mL；

m——样品质量。

5.说明及注意事项

（1）食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇、速甾醇等成分的含量往往大大超过维生素D的含量，严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。

（2）操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响，可使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍，并可减少部分甾醇的干扰。

（3）此法不能区分维生素D2和维生素D3，测定值为两者的总量。