维生素A的测定方法：三氯化锑比色法

维生素A是由β-紫罗酮环与不饱和一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称，包括维生素A1和维生素A2。维生素A1即视黄醇，它有多种异构体，维生素A2即3-脱氢视黄醇，是视黄醇（维生素A1）衍生物之一，它也有多种异构体，其化学结构式如下：

维生素A1还有许多种衍生物，包括视黄醛（维生素A1末端的—CH2OH氧化成—CHO）、视黄酸（—CHO进一步被氧化成—COOH）、3-脱氢视黄醛、3-脱氢视黄酸及其各类异构体，它们也都具有维生素A的作用，总称为类视黄素。

维生素A的测定方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光法、气相色谱法和高效液相色谱法等，其中比色法应用最为广泛。

1.原理

维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。

2.试剂

（1）无水硫酸钠（不吸附维生素A）。

（2）乙酸酐。

（3）无水乙醚（不含有过氧化物）。检查方法：取5mL乙醚，加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如果含过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色；或加入4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。去除过氧化物的方法：重蒸乙醚时，弃去10%初馏液和10%残留液。

（4）无水乙醇（不得含有醛类物质）。检查方法：在盛有2mL银氨溶液的小试管中，加入35滴无水乙醇，摇匀，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中含有醛。

脱醛方法：取2g硝酸银，溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入盛有1L乙醇的试剂瓶内，振摇后，暗处放置2d（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初馏液50mL若乙醇中含醛较多时，可适当增加硝酸银用量。

（5）三氯甲烷。应不含分解物，否则会破坏维生素A。

（6）250g/L三氯化锑-三氯甲烷溶液。用三氯甲烷配制250g/L三氯化锑溶液，储于棕色瓶中（注意勿使吸收水分）。

（7）50%氢氧化钾溶液。取50g氢氧化钾，溶于50g水中，混匀。

（8）维生素A或视黄醇乙酸酯标准液。视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸酯（90%）经皂化处理后使用，用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇，临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。

（9）酚酞指示剂。用95%乙醇配制10g/L溶液。

3.仪器和设备

分光光度计、回流冷凝装置。

4.操作步骤

（1）样品处理。根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。

①皂化法。适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。

皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取0.5～5g样品于锥形瓶中，加入10mL氢氧化钾及20～40mL乙醇，于电热板上回流30min至皂化完全为止。

提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL，水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有残渣，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL，乙醚分2次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入锥形瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。(www.xing528.com)

洗涤：用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层，加15～20mL0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，去除醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止（大约3次），醚层液静置10～20min，小心放出析出的水。

浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入锥形瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠2次，洗液并入锥形瓶内。置水浴上蒸馏，收回乙醚。待瓶中剩约5mL，乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内（3～5μg/mL）。

②研磨法。适用于每克样品维生素A含量大于5～10μg样品的测定，如动物肝的检测。步骤简单，省时，结果准确。

研磨：精确称2～5g样品，放入盛有3～5倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。

提取小心地将全部均质化样品移入带盖的锥形瓶内，准确加入50～100mL乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A完全溶于乙醚中。使其自行澄清（大约需1～2h），或离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中）。

浓缩：取澄清乙醚液2～5mL放入比色管中抽气蒸干，立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。

（2）测定。

①标准曲线的制备。准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色管序列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色管序列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑-三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。

②样品测定。于一比色管中加入10mL三氯甲烷，以1滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1mL三氧甲烷，其余比色管中分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。

5.计算

式中：x——样品中维生素A的含量，μg/100g（或国际单位，每国际单位=0.3μg维生素A）；

c——由标准曲线上查得样品中维生素A的含量，μg/mL；

m——样品质量，g；

V——提取后加三氯甲烷定量的体积，mL；

100——以每百克样品计。

6.说明及注意事项

（1）本法为国家标准方法，适用于食品中维生素A的测定。

（2）乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取前，洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇消除乳化。

（3）所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每1mL氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。

（4）由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常6s以后便开始褪色，因此要求反应在比色皿中进行，产生蓝色后立即读取吸光度值。

（5）如果样品中含β-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮-己烷混合液为洗脱剂进行柱层析。

（6）三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再进行清洗。