直接滴定法测定还原糖的含量

能使氧化剂还原的糖称还原糖。单糖都是还原糖，乳糖和麦芽糖分子中含有游离的半缩醛羟基，因而它们都具有还原性，是还原糖。而非还原性糖类，如一些双糖、三糖、多糖等（常见的蔗糖、糊精、淀粉等都属此类），可以通过水解而生成具有还原性的单糖，通过测定水解液的还原糖量，再换算成样品中的相应的糖类的含量。因此还原糖的测定是糖类测定的基础。

（一）直接滴定法

此法是目前常用的测定还原糖的方法，适用于各类食品中还原糖的测定。它具有试剂用量少，操作简单、快速、滴定终点明显等特点。但对深色样品（如酱油、深色果汁等）因色素干扰而使终点不易判断，从而影响其准确性而不适用。本法食品分析与检验是国家标准分析方法。

1.原理

将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等体积混合后，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液直接滴定经标定的碱性酒石酸铜溶液，样液中的还原糖与二价铜反应生成氧化亚铜，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖将次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。根据所消耗的样液量，即可计算出还原糖的含量。

实际上，还原糖在碱性溶液中与硫酸铜的反应过程极为复杂，因此要用已知浓度的葡萄糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液，或利用通过实验编制出来的还原糖检索表来计算。

2.仪器和试剂

（1）仪器。

①酸式滴定管。

②可调电炉。

（2）试剂。

①碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000mL。

②碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

③乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加3mL冰醋酸，加水溶解并稀释至100mL。

④亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]溶于水中，稀释至100mL。

⑤盐酸。

⑥葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g于98℃～100℃烘干至恒重的无水葡萄糖，加水溶解后，加入5mL盐酸（防止微生物生长），转移入1000mL容量瓶中，用水定容。

3.操作步骤

（1）样品处理。

①对于乳类、乳制品及含蛋白质的冷食类：称取2.50～5.00g固体样品或吸取25.00～50.00mL液体样液，置于250mL容量瓶中，加水50mL，慢慢加入5mL醋酸锌及5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀后静置30min；用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，收集滤液供备用。

②对于淀粉含量较高的样品：称取10.00～20.00g样品，置于250mL容量瓶中，加水200mL在45℃水浴中加热1h，时时振摇。取出冷却后加水至刻度，混匀，静置；吸取200mL上清液于另一个250mL容量瓶中，以下按①项操作。

③酒精性饮料：吸取100.0mL试样，置于蒸发皿中，用氢氧化钠（40g/L）溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中，加水至刻度。

④汽水等含有二氧化碳的饮料：吸取100.0mL试样置于蒸发皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250mL容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀后备用。

（2）碱性酒石酸铜溶液的标定。准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5.0mL于150mL锥形瓶中。加水10mL，加入玻珠2粒。从滴定管中滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2min内沸腾，趁沸以每1滴/2秒的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至蓝色刚好退去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，平行操作3份，取其平均值。

计算每10mL（甲、乙液各5mL。）碱性酒石酸铜溶液，相当于葡萄糖的质量：

式中：ρ2——10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg；

ρ1——葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；

V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

（3）样液的预测定。准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5.0mL于150mL锥形瓶中。加水10mL，加入玻珠2粒，加热使其在2min.内沸腾，趁沸以先快后慢的速度从滴定管中滴加样液，滴定时须始终保持溶液呈微沸腾状态。待溶液颜色变浅时，以每1滴/2秒的速度继续滴定，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样液的体积。

（4）样液的测定。准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5.0mL于150mL锥形瓶中。加水10mL，加入玻珠2粒，从滴定管中加入比预测定时少1mL的样液，加热使其在2min内沸腾，趁沸以每1滴/2秒的速度继续滴定，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样液的总体积。同法平行操作3份，取其平均值。

4.结果计算

式中：w——样品中还原糖（以葡萄糖计）的质量分数，%；

F——10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg；

m——样品质量，g；

V——测定时平均消耗样液的体积，mL；

250——为样品溶液的总体积，mL。

5.说明与注意事项

（1）碱性酒石酸铜甲液、乙液应分别配制贮存，用时才能混合。否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

（2）样品溶液预测的目的：一是通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，使预测时消耗样液量在10mL左右，还原糖液浓度在0.1%左右，与标准葡萄糖溶液的浓度相近；二是通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1mL左右的样液，只留下1mL左右样液在续滴定时加入，以保证和标定时的完全相同的滴定条件，减少因滴定操作带来的误差，提高测定的准确度。

（3）亚铁氰化钾的加入可以消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，因为它可以与滴定时生成的红色氧化亚铜沉淀络合成无色的络合物，由此消除红色沉淀对滴定终点的干扰，使终点变色更明显。

（4）作为指示剂的次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下其氧化能力比Cu2+弱，故还原糖先与Cu2+反应，待Cu2+完全反应后，稍过量的还原糖才会与次甲基蓝发生反应，使之由蓝色变为无色，来指示终点到达。

（5）整个滴定过程必须在沸腾条件下进行，其目的是为了加快还原糖与Cu2+的反应速度和防止空气进入反应样液——避免氧化亚铜和还原型的次甲基蓝被氧化而增加耗糖量，从而引入误差。

（6）测定中反应液碱度、滴定速度、热源强度及煮沸时间等都对测定结果有很大的影响。反应中反应液的体积、标定和测定时消耗的体积应接近才可以保证反应液碱度一致。热源强度、滴定速度和煮沸时间应严格按照操作中规定的执行，否则，加热至煮沸时间不同，蒸发量不同，反应液的碱度也不同，从而引入误差。

（7）上述介绍的测定结果是以葡萄糖计的还原糖的测定方法，如果是以其他还原糖来表示测定结果，则碱性酒石酸铜溶液的标定应采用相应的还原糖标准溶液。

（二）高锰酸钾滴定法

该法是国家标准分析方法，它适用于各类食品中还原糖的测定，对于深色样液也同样适用。这种方法的主要特点是准确度高，重现性好，这两方面都优于直接滴定法。但操作复杂、费时，需查特制的高锰酸钾法糖类检索表。

1.原理

将还原糖与过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖与Cu2+反应生成Cu2O沉淀。过滤分离，得到Cu2O沉淀，加入过量的酸性硫酸铁溶液将其溶解，Fe3+被定量地还原成Fe2+，再用高锰酸钾溶液滴定所生成的Fe2+，由高锰酸钾标准溶液的消耗量可计算出生成的Cu2O的量，通过专用的检索表中查出与氧化亚铜量相当的还原糖量，即可计算出样品中还原糖的含量。反应方程式如下：

由上反应可见，5molCu2O相当于2mol的KMnO4，故根据高锰酸钾标准溶液的消耗量可计算出氧化亚铜的量。再由氧化亚铜量查表得到相应的还原糖的量。

2.仪器和试剂

（1）仪器。25mL古氏坩埚或G4垂熔坩埚、真空泵或水力真空管。

（2）试剂。

①碱性酒石酸铜甲液：称取35.639g硫酸铜（CuSO4·5H2O），加适量水溶解，加0.5mL硫酸，加水稀释至500mL，用精制石棉过滤。

②碱性酒石酸铜乙液：称取173g酒石酸钾钠和50g氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至500mL，用精制石棉过滤，贮存于具橡胶塞的玻璃瓶内。

③精制石棉：取石棉，先用3mol/L盐酸浸泡2～3h，用水洗净，再用400g/L氢氧化钠溶液浸泡2～3h，倾去溶液，再用碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净，再以3mol/L盐酸浸泡数小时，以水洗至不显酸性。加水振荡，使之成为微细食品分析与检验的浆状软纤维，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用于填充古氏坩埚。

④高锰酸钾标准溶液（0.1000mol/L）。

a.配制：称取16.0g高锰酸钾溶于1000mL水中，缓缓煮沸20～30min，冷却后于暗处密封保存数日，用垂熔漏斗过滤，保存于棕色瓶中。

b.标定：准确称取于105℃～200℃干燥1～1.5h的基准草酸钠约0.2g，溶于50mL水中，加8mL硫酸，用配制的高锰酸钾滴定，接近终点时加热到70℃，继续滴至溶液显粉红色30s不褪色为止。同时做空白试验。(www.xing528.com)

c.计算：

式中：c——KMnO4标准溶液浓度，mol/L；

m——基准草酸钠质量，g；

V——标定时消耗高锰酸钾体积，mL；

V0——空白时消耗高锰酸钾体积，mL；

134——Na2C2O4的摩尔质量，g/moL。

（3）1mol/LNaOH溶液：称取4g氢氧化钠，加水溶解并定容至100mL。

（4）硫酸铁溶液：称取50g硫酸铁，加入200mL水溶解后，慢慢加入100mL硫酸，冷却加水稀释至1000mL。

（5）3mol/LHCl溶液：30mL盐酸加水稀释至120mL即可。

3.操作步骤

（1）样品处理。

①乳类、乳制品及含蛋白质的冷食类：称取2.50～5.00g固体样品。（液体样品吸取25.00～50.00mL）于250mL容量瓶中，加50mL溶液至刻度，摇匀后加10mL碱性酒石酸铜甲液及4mL1mol/L氢氧化钠溶液至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。

②酒精性饮料：吸取100.00mL样品，置于蒸发皿中，用1mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中，加水50mL，混匀。以下按①中自“加10mL碱性酒石酸铜甲液”起依法操作。

③淀粉含量较高的食品：精密称取10.00～20.00g样品，置于250mL容量瓶中，加入200mL水，于45℃水浴中加热1h，并不断振摇，之后冷却，加水至刻度，混匀静置。吸取200mL上清液于另一个250mL容量瓶中，以下按①中自“加10mL碱性酒石酸铜甲液”起依法操作。

④汽水等含二氧化碳的饮料：吸取样液100.0mL，于蒸发皿中，在水浴上蒸发除去二氧化碳后，移入250mL容量瓶中，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。

（2）测定。准确吸取经处理后的样液50.00mL于400mL烧杯中，加入碱性酒石酸铜甲、乙液各25mL，于烧杯上盖上表面皿，加热，控制在4min内沸腾，再准确煮沸2min，趁热用铺好石棉的古氏坩埚或G4垂熔坩埚抽滤，并用60℃的热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不显碱性为止。将垂熔坩埚或古氏坩埚放回原400mL烧杯中，加25mL硫酸铁溶液和25mL水，用玻璃棒搅拌，使氧化亚铜完全溶解，用高锰酸钾标准溶液滴定至微红色为终点。

同时按上述方法做空白试验，其中以水50mL代替样液。记录空白试验消耗高锰酸钾标准溶液的量。

4.结果计算

（1）根据滴定时所消耗的高锰酸钾标准溶液的量，计算相当于样品中还原糖的氧化亚铜的量：

式中：w1——氧化亚铜的质量分数，%；

V——测定样液所消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；

V0——试剂空白所消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；

c——KMnO4标准溶液的实际浓度，mol/L；

143.08——氧化亚铜的摩尔质量，g/moL。

（2）根据上式计算所得氧化亚铜量查表得出相当于还原糖的量，再按下式计算样品中还原糖的含量。

式中：w2——还原糖的质量分数，%；

m1——由氧化亚铜的量查表得出的还原糖的质量，mg；

m——样品质量，g；

V1——样品处理液总体积，mL；

V2——测定用样品处理液的体积，mL。

5.说明及注意事项

（1）取样量视样品含糖量而定，一般样品中含糖25～1000mg，测定用样液含糖浓度应调整到0.01%～0.45%，以免引入误差。通常进行预实验，确定样液的稀释倍数后再进行正式测定。

（2）操作过程必须严格按规定执行，加入碱性酒石酸铜甲、乙液后，严格控制在4min内加热至沸，沸腾时间2min也要准确；否则会引起较大的误差。一般可用50mL的水代替样液，再加入相同的碱性酒石酸铜甲、乙液来做加热条件摸索。

（3）如煮沸后的反应液不显蓝色，说明样液含糖浓度过高，应调整样液浓度，或食品分析与检验减少样液取用体积，重新操作，而不能增加碱性酒石酸铜甲、乙液的用量。

（4）在抽滤和洗涤时，要使沉淀始终在液面下，防止氧化亚铜沉淀暴露在空气中，避免其氧化。

（三）蓝-爱农法

蓝-爱农（Lane-Eynon）法是许多国家和国际组织测定还原糖的标准分析方法。我国虽然没把此法定为标准分析方法，而是把其改良法——快速直接滴定法——规定为标准分析方法，但此法仍应用于一些科研、生产中糖的定量。

1.原理

同直接滴定法。

2.试剂

（1）斐林试剂甲、乙液。同高锰酸钾滴定法。

（2）乙酸锌溶液、亚铁氰化钾溶液。同直接滴定法。

（3）1%次甲基蓝溶液。称取1g次甲基蓝，加100mL水加热溶解，贮存于棕色瓶中。

（4）0.2%葡萄糖标准溶液。准确称取2.0000g无水葡萄糖（预先在100℃～105℃烘干）用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

3.测定步骤

（1）样品处理。同直接滴定法。

（2）样液预测。吸取斐林试剂甲、乙液各5.00mL于250mL锥形瓶中，从滴定管中加入样液约15mL，把锥形瓶放在石棉网上加热使其在2min内至沸，维持沸腾2min，加入3滴次甲基蓝，继续滴加样液（滴加速度控制在使糖液维持沸腾状态）至溶液蓝色刚好褪去为止。记录样液消耗总体积数。

（3）样液的测定。吸取斐林试剂甲、乙液各5.00mL于250mL锥形瓶中，从滴定管加入样液，其量比预测时所消耗的样液总量少0.5～1mL加热锥形瓶使之在2min内至沸，维持沸腾2min，加入3滴次甲基蓝指示剂，再以1滴/2秒的速度继续滴加样液，直至蓝色褪去为终点。继续滴定应控制在1min内完成。记录样液总消耗量。

4.结果计算

式中：F——还原糖因数，即10mL斐林试剂（甲、乙液各5mL）相当的还原糖量，mg；

V1——滴定时消耗样液量，mL；

V——样液总量，mL；

m——样品质量，g。

还原糖因数可以用标准还原糖溶液，按样品测定的方法标定10mL斐林试剂而求得，此法误差为0.5%。也可以利用蓝-爱农法专用的“还原糖因数表”查得，此法误差为1%。目前多采用前一种方法。

5.说明

（1）用本法测定加糖乳制品时，蔗糖的存在会使滴定时样液的消耗量减少，使测定结果偏高，故当蔗糖与乳糖的含量比超过3：1时，应加以校正。

（2）操作中的有关说明同直接滴定法。