蛋白质测定：凯氏定氮法

新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，不同的蛋白质含氮量不同。一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25；花生为5.64；大米为5.95；大豆及其制品为5.71；小麦粉为5.70；高粱为6.24；大麦、小米、燕麦等为5.83；牛乳及其制品为6.38；肉与肉制品为6.25；芝麻、向日葵为5.30。所以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定，它的最低检出量为0.05mg氮，相当于0.3mg蛋白质。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。

凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，经长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量等多种方法。

（一）常量凯氏定氮法

1.原理

样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水蒸气逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。以甘氨酸为例，该过程的反应方程式如下：

消化　2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O

在消化过程中，浓硫酸具有脱水性和炭化性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫：

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中：

在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列催化剂。

（1）硫酸钾。加入硫酸钾的目的是为了提高溶液的沸点，加快有机物的分解。硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点为340℃左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高至400℃以上，而且随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸氢钾的浓度逐渐增大，故沸点不断升高，其反应式如下：

但是，硫酸钾的加入量也不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解析出氨而造成损失：

除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。

（2）硫酸铜。硫酸铜在消化中起催化剂的作用。并且，蓝色的硫酸铜溶液还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

除硫酸铜外，凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，还有氧化汞、汞、硒粉等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。另外，使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化分解。

2.主要仪器。

凯氏烧瓶（500mL），定氮蒸馏装置，如图5-6所示。

图5-6　凯氏定氮消化、蒸馏装置

1.水力真空管；2.水龙头；3.倒置的干燥管；4.凯氏烧瓶；5，7.电炉；6，9.铁支架；8.蒸馏烧瓶；10.进样漏斗；11.冷凝管；12.吸收瓶

3.试剂

（1）浓硫酸。

（2）硫酸铜。

（3）硫酸钾。

（4）400g/L氢氧化钠溶液。

（5）40g/L硼酸吸收液。称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。

（6）甲基红-溴甲酚绿混合指示剂。5份2g/L溴甲酚绿95%乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙醇溶液临用时混合均匀。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

（7）0.1000mol/L盐酸标准溶液。

4.操作方法

准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液体样品10～20mL），小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀，按图5-6安装消化装置，并将其以45°斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。冷却，小心加入200mL蒸馏水，待完全冷却后，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。

将凯氏烧瓶按图5-6蒸馏装置方式连好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装入50mL40g/L硼酸溶液及混合指示剂2～3滴）。放松漏斗夹子，通过漏斗加入70～80mL400g/L氢氧化钠溶液，并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再加入100mL蒸馏水（从漏斗中加入），夹紧漏斗夹子，加热蒸馏至氨全部蒸出（馏出液约250mL即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。

将上述吸收液用0.1000mol/LHCl标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液用量，同时做试剂空白（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白试验消耗盐酸标准溶液的体积。

5.计算

式中：w——蛋白质的质量分数，%；

c——盐酸标准液的浓度，mol/L；

V0——空白滴定消耗标准液的体积，mL；

V1——试样滴定消耗标准液的体积，mL；

14——氮的毫摩尔质量，g/mmol；

F——氮换算为蛋白质的系数；

m——样品质量，g。

6.说明及注意事项

（1）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。

（2）消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，注意不断转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。

（3）样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入少量辛醇或液状石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。(www.xing528.com)

（4）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL后再继续加热消化。

（5）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样加5mL的比例增加硫酸用量。

（6）一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液应呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。

（7）蒸馏装置不能漏气。

（8）蒸馏前若加碱量不足，消化液在蒸馏时不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。

（9）硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。

（10）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。

（二）微量凯氏定氮法

1.原理

同常量凯氏定氮法。

2.主要仪器

（1）凯氏烧瓶（100mL）。

（2）微量凯氏定氮蒸馏装置，如图5-7所示。

图5-7　微量凯氏定氮装置

1.蒸汽发生器；2.安全管；3.导管；4.汽水分离器；5.进样口；6.橡皮管及夹子；7.反应管；8.隔热套；9.吸收瓶；10.冷凝管

3.试剂

（1）0.0100mol/L盐酸标准溶液。

（2）20g/L硼酸吸收液：称取20g硼酸溶解于1000mL热水中，摇匀备用。

（3）其他试剂同常量凯氏定氮法。

4.操作方法

（1）样品消化。精密称取均匀固体样品0.2～2.0g，或半固体样品2～5g或吸取液体样品10～20mL，小心移入100mL干燥的凯氏烧瓶中。向瓶内加入0.2g硫酸铜、3g硫酸钾及一定量的浓硫酸（每克样品加硫酸15mL），将凯氏烧瓶45°倾斜置于电炉上。同常量法消化至消化液呈透明蓝绿色溶液时，再继续加热0.5h，完成消化。待消化液冷至室温后，用蒸馏水干净地转入100mL容量瓶中，并用蒸馏水定容，摇匀，备用。

（2）蒸馏与吸收。按图5-7连接好微量定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。检查装置的气密性。

在接收瓶内加入25mL20g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确量取消化稀释液10mL，经漏斗加入反应管内，用少量蒸馏水冲洗漏斗。经漏斗再加入10mL400g/L氢氧化钠溶液，使呈强碱性，立即夹好漏斗夹，并加少量水于进样漏斗中封口，以防漏气。夹紧废液排出口的螺旋夹，进行水蒸气蒸馏。蒸馏至冷凝管下端的吸收液变为绿色开始计时，继续蒸馏3min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。蒸馏结束时，夹紧簧夹，断绝蒸汽，使蒸馏瓶内的溶液吸入回流管中。松开弹簧夹，从漏斗加入蒸馏水40～50mL，再通蒸汽加热回流，将蒸馏瓶洗涤一次备用。

（3）滴定。吸收液用0.0100mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。

（4）空白试验。不加试样，按上述操作做空白试验。

5.计算

式中：w——蛋白质的质量分数，%；

V0——滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；

V1——滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；

c——盐酸标准液的浓度，mol/L；

0.014——氮的摩尔质量，g/mol；

F——蛋白质系数；

m——样品质量，g；

V2——蒸馏所加样品消化液的量，mL。

6.说明

（1）蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3体积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果，同时可以指示因水蒸气气压不足而使氨气发生倒吸溶于水中，使得测定结果偏低。

（2）在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。

（3）加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。