食品中还原糖的测定实验

内容一 直接滴定法

一、实验目的

（1）了解碳水化合物存在于食品的种类。

（2）掌握还原糖的分析检测方法。

（3）掌握氧化还原滴定在食品理化分析的检验应用技能。

二、实验原理

在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用除蛋白质后的试样溶液进行滴定，试样溶液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖立即把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。根据试样溶液消耗量，计算出还原糖含量。

本方法是国家标准分析方法，试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显，适用于食品中还原糖含量的测定。但在分析测定酱油、深色果汁等试样时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

淀粉的食品、酒精饮料、碳酸饮料水果、罐头等。

2.仪器

（1）天平 感量为0.1mg。

（2）水浴锅。

（3）可调温电炉。

（4）酸式滴定管25mL。

3.试剂

（1）盐酸溶液（体积比1∶1）量取盐酸50mL，加水50mL混匀。

（2）碱性酒石酸铜甲液 称取15g硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释到1000mL。

（3）碱性酒石酸铜乙液 称取50g酒石酸钾钠、75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，储存于橡皮塞玻璃瓶中。

（4）乙酸锌溶液 称取21.9g乙酸锌，加3mL冰乙酸，加水溶解并稀释到100mL。

（5）亚铁氰化钾溶液 称取10.6g亚铁氰化钾，溶于水中，稀释至100mL。

（6）氢氧化钠溶液（40g/L）称取氢氧化钠4g，加水溶解后，放冷，并定容至100mL。

（7）葡萄糖（C₆H₁₂O₆）CAS：50-99-7，纯度≥99%。

（8）葡萄糖标准溶液（1.0mg/mL）：准确称取经过∶（98±2）℃烘箱中干燥2h后的葡萄糖，加水溶解后加入盐酸溶液5mL（防止微生物生长），并用水定容至1000mL。此溶液每毫升相当于1.0mg葡萄糖。

四、实验步骤

（1）试样制备

①含淀粉的食品：称取粉碎或混匀后的试样10.00～20.00g试样，置于250mL容量瓶中，加200mL水，在45℃水浴中加热1h，并时时振摇。冷却后加水至刻度，混匀，静置，沉淀。吸取200mL上清液于另一个250mL容量瓶中，慢慢加入5mL乙酸锌和5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，沉淀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。

②酒精饮料：称取混匀后的试样100g（精确至0.01g），置于蒸发皿中，用氢氧化钠溶液中和至中性，在水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中，缓慢加入乙酸锌溶液5mL和亚铁氰化钾溶液5mL，加水至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。

③碳酸饮料：称取混匀后的试样100g（精确至0.01g）于蒸发皿中，在水浴上微热搅拌除去二氧化碳后，移入250mL容量瓶中，用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶，加水至刻度，混匀后备用。

④其他食品：称取粉碎后的固体试样2.5～5g（精确至0.001g）或混匀后的液体试样5～25g（精确至0.001g），置250mL容量瓶中，加50mL水，缓慢加入乙酸锌溶液5mL和亚铁氰化钾溶液5mL，加水至刻度，混匀，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。

（2）碱性酒石酸铜溶液的标定 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各5.0mL，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加玻璃珠2～4粒，从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。同时平行操作3份，取其平均值，计算每10mL（碱性酒石酸甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖（或其他还原糖）的质量（mg）。

（3）试样溶液预测 吸取碱性酒石酸铜甲液、乙液各5.0mL，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加2～4粒玻璃珠，在2min内加热至沸腾状态，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加试样溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态。待溶液蓝色变淡时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录试样溶液消耗的体积。[注意：当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释后再进行正式测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约10mL左右，结果按式（8-19）计算；当浓度过低时则采取直接加入10mL样品液，免去加水10mL，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10mL样液中所含还原糖的量，结果按式（8-20）计算。]

（4）试样溶液测定 吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各5.0mL，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加玻璃珠2～4粒，从滴定管中加入比预测时试样溶液消耗总体积少1mL的试样溶液至锥形瓶中，加热使其在2min内达到沸腾状态，趁沸以每2s一滴的速度继续滴加试样溶液，直至蓝色刚好褪去即为终点。记录消耗试样溶液的总体积。同法平行操作3份，取其平均值。

五、结果与讨论

试样中还原糖的含量（以某种还原糖计）按式（8-19）计算：

式中 X——试样中还原糖的含量（以某种还原糖计），g/100g；

m₁——碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）相当于某种还原糖的质量，mg；

m——试样质量，g；

F——系数，“试样制备”①③④为1；“试样制备”②为0.80；

V——测定时平均消耗试样溶液体积，mL；

250——定容体积，mL；

1000——换算系数。

当浓度过低时，试样中还原糖的含量（以某种还原糖计）按式（8-20）计算：

式中 X——试样中还原糖的含量（以某种还原糖计），g/100g；

m₂——标定时体积与加入样品后消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于某种还原糖的质量，mg；

m——试样质量，g；

F——系数，“试样制备”①③④为1；“试样制备”②为0.80；

10——样液体积，mL；

250——定容体积，mL；

1000——换算系数。

还原糖含量＞10g/100g时，计算结果保留三位有效数字；还原糖含量＜10g/100g时，计算结果保留两位有效数字。

精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

六、注意事项

（1）碱性酒石酸铜甲液的配制，一定是选择硫酸铜（CuSO₄·5H₂O），不能误选无水硫酸铜（CuSO₄）。

（2）实验中碱性酒石酸铜甲液和乙液各5.0mL可以改变，新的标准中可以选择4～20mL碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）来适应试样中还原糖的浓度变化。

（3）150mL锥形瓶的选择。因氧化还原滴定中容器的体积会影响实验误差，故锥形瓶要选择相同体积的，即150mL锥形瓶。

（4）滴定时要保持沸腾状态，使上升蒸汽阻止空气侵入滴定反应体系中。一方面，加热可以加快还原糖与Cu²⁺的反应速度；另一方面，次甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇到空气中的氧时又会被氧化为其氧化型，再变为蓝色。此外，氧化亚铜也极不稳定，容易与空气中的氧结合而被氧化，从而增加还原糖的消耗量。

（5）试样溶液预测之前，可以先用移液管试探加入沸腾的碱性酒石酸铜甲液、乙液中，取得试样大致的含糖量，然后再考虑试样的稀释或碱性酒石酸铜甲液、乙液的体积选择。

思考题

1.为什么说用凯氏定氮法测定出食品中的蛋白质含量为粗蛋白含量？

2.在消化过程中加入的硫酸铜、硫酸钾试剂有哪些作用？

3.试述蛋白质测定中，试样消化过程所必须注意的事项，消化过程中试样颜色发生什么变化？为什么？

参考文献

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会．GB 5009.7-2016 食品安全国家标准食品中还原糖的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

内容二 高锰酸钾滴定法

一、实验目的(www.xing528.com)

（1）还原糖检测技能。

（2）不同试样制备技能。

二、实验原理

试样经除去蛋白质后，其中还原糖把铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后，氧化亚铜被氧化为铜盐，经高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据高锰酸钾消耗量，计算氧化亚铜含量，再查表得还原糖量。

本法为国家标准分析方法，适用于包括有色试样溶液在内的各类食品中还原糖的测定。优点是重现性好，准确度高；缺点是操作复杂，耗时太长，计算结果时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

肉与肉制品、乳制品、蛋品、粮食等。

2.仪器

（1）天平 感量为0.1mg。

（2）水浴锅。

（3）可调温电炉。

（4）酸式滴定管25mL。

（5）25mL古氏坩埚或G4垂融坩埚。

（6）真空泵。

3.试剂

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682-2008规定的三级水。

（1）盐酸溶液（3mol/L）量取盐酸30mL，加水稀释至120mL。

（2）碱性酒石酸铜甲液 称取34.639g硫酸铜（CuSO₄·5H₂O），加适量水溶解，加入0.5mL硫酸，再加水稀释至500mL，用精制石棉过滤。

（3）碱性酒石酸铜乙液 称取173g酒石酸钾钠和50g氢氧化钠，加适量水溶解并稀释到500mL，用精制石棉过滤，储存于橡胶塞玻璃瓶中。

（4）氢氧化钠溶液（40g/L）称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100mL。

（5）硫酸铁溶液（50g/L）称取50g硫酸铁，加入200mL水溶解后，慢慢加入100mL硫酸，冷却后加水稀释至1000mL。

（6）精制石棉 取石棉，先用盐酸（3mo1/L）浸泡2d～3d，用水洗净，再用200g/L氢氧化钠浸泡2～3d，倾去溶液，再用碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净。再以3mol/L盐酸浸泡数小时，用水洗至不呈酸性。加水振荡，使成微细的浆状软纤维，用水浸泡并储存于玻璃瓶中，可用于填充古氏坩埚。

（7）高锰酸钾标准溶液（0.1mol/L）称取3.3g高锰酸钾溶于1000mL水中，缓缓煮沸15～20min，冷却后于暗处密闭保存数日，用垂融漏斗过滤，保存于棕色瓶中。

（8）葡萄糖标准溶液（1.0mg/mL）准确称取经过（98±2）℃烘箱中干燥2h后的葡萄糖，加水溶解后加入盐酸溶液5mL（防止微生物生长），并用水定容至1000mL。此溶液每毫升相当于1.0mg葡萄糖。

标定：精确称取110～150℃干燥恒重的基准草酸钠约0.2g，溶于250mL新煮沸过的冷水中，加10mL硫酸，加入约25mL配制的高锰酸钾溶液，加热至65℃，用高锰酸钾溶液滴定至溶液呈微红色，保持30s不褪色为止。在滴定终了时溶液温度应不低于55℃。同时做空白试验。

四、实验步骤

（1）试样制备 同“内容一 直接滴定法”。

（2）试样溶液测定 吸取50.00mL处理后的试样溶液于500mL烧杯中，加碱性酒石酸铜甲液、乙液各25mL，于烧杯上盖一表面皿，加热，控制在4min内沸腾，再准确沸腾2min，趁热用铺好精制石棉的古氏坩埚或G4垂融坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不呈碱性为止。

将古氏坩埚或G4垂融坩埚放回原500mL烧杯中，加入硫酸铁溶液25mL和水25mL，用玻璃棒搅拌使氧化亚铜完全溶解，以高锰酸钾标准溶液滴定至微红色为终点。记录高锰酸钾标准溶液的消耗量。

同时吸取水50mL代替试样溶液，加入与测定试样时相同量的碱性酒石酸铜甲液、乙液、硫酸铁溶液及水，按同一方法做空白试验。

五、结果与讨论

试样中还原糖的质量相当于氧化亚铜的质量，按式（8-21）进行计算：

式中 X₀——试样中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，mg；

V——测定用试样溶液消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；

V₀——试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，mL；

C——高锰酸钾标准溶液的浓度，moL/L；

71.54——1mL高锰酸钾标准溶液[C（1/5KMnO₄）=1.000mol/L]相当于氧化亚铜的质量，mg。

根据式（8-21）中计算所得的氧化亚铜质量，查“相当于氧化亚铜质量的葡萄糖、果糖、乳糖、转化糖的质量表”（本实验附表），再计算试样中还原糖的含量，如式（8-22）所示。

式中

X——试样中还原糖的含量，g/100g；

m₃——查表得的还原糖质量，mg；

m₄——试样质量（或体积），g或mL；

V——测定用试样溶液的体积，mL；

250——试样处理后的总体积，mL；

100、1000——换算系数。

还原糖含量≥10g/100g时，计算结果保留三位有效数字；还原糖含量＜10g/100g时，计算结果保留两位有效数字。

精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

六、注意事项

（1）此法又称贝尔德蓝（Bertrand）法。还原糖能在碱性溶液中将两价铜离子还原为棕红色的氧化亚铜沉淀，而糖本身被氧化为相应的羧酸。这是还原糖定量分析和检测的基础。

（2）此法以高锰酸钾滴定反应过程中产生的定量的硫酸亚铁为结果计算的依据，因此，在试样处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为糖液的澄清剂，以免引入Fe²⁺，造成误差。

（3）测定必须严格按规定的操作条件进行，必须使加热至沸腾时间及保持沸腾时间严格保持一致。即必须控制好热源强度，保证在4min内加热至沸，并使每次测定的沸腾时间保持一致，否则误差较大。实验时可先取50mL水，碱性酒石酸铜甲液、乙液各25mL，调整热源强度，使其在4min内加热至沸，维持热源强度不变，再正式测定。

（4）此法所用碱性酒石酸铜溶液是过量的，即保证把所有的还原糖全部氧化后，还有过剩的Cu²⁺存在，所以，煮沸后的反应液应呈蓝色。如不呈蓝色，说明试样溶液含糖浓度过高，应调整试样溶液浓度。

（5）此法测定食品中的还原糖测定结果准确性较好，但操作烦琐费时，并且在过滤及洗涤氧化亚铜沉淀的整个过程中，应使沉淀始终在液面以下，避免氧化亚铜暴露于空气中而被氧化，同时严格掌握操作条件。

思考题

高锰酸钾法测定还原糖应注意什么？

附表 相当于氧化亚铜质量的葡萄糖、果糖、乳糖、转化糖质量表

续表

续表

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续表

续表

续表

参考文献

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会．GB 5009.7-2016 食品安全国家标准食品中还原糖的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.