食品中蛋白质测定实验

内容一 凯氏定氮法测定食品中蛋白质

一、实验目的

（1）掌握食品中蛋白质的测定方法。

（2）掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理以及操作技术。

（3）学会微量凯氏定氮装置的准确无损安装以及清洗、蒸馏吸收方法。

二、实验原理

试样、浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而试样中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨逸出，用硼酸溶液吸收后，再以标准盐酸溶液滴定。根据消耗的标准盐酸液的体积可计算蛋白质的含量。

根据试样测试步骤，包括以下几个方面。

（1）消化 将试样与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而试样中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。

在消化过程，利用浓硫酸的脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。反应式为：

同时浓硫酸又具有氧化性，使炭化后的碳进一步氧化为二氧化碳，硫酸同时被还原成二氧化硫，反应式为：

最后，二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中：

（2）蒸馏 在消化完全的试样消化液中加入碱液（浓氢氧化钠）使之碱化，消化液中的氨被游离出来，通过加热蒸馏释放出氨气，反应方程式如下：

（3）吸收与滴定 蒸馏所释放出来的氨，用弱酸溶液（如硼酸）进行吸收，与氨形成强碱弱酸盐，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定。吸收及滴定反应方程式如下：

本测定中滴定指示剂是用按一定比例配成的甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。甲基红在pH 4.2～6.3之间变色，由红变为黄，终点为橙色，溴甲酚绿在pH 3.8～5.4之间变色，由黄变蓝，终点为绿色。当两种指示剂按适当比例混合时，在pH 5以上呈绿色，在pH 5以下为橙红色，在pH 5时因互补色关系呈紫灰色，因此滴定终点十分明显，易于掌握。

凯氏定氮法可适用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

肉与肉制品、乳制品、蛋品、粮食等。

2.仪器

（1）天平 感量为1mg。

（2）定氮蒸馏装置 如图8-6、图8-7所示。或自动凯氏定氮仪。

（3）消化炉（配套消化管）或定氮瓶。

图8-6 定氮蒸馏装置图

1—电炉 2—水蒸气发生器（2L烧瓶）3—螺旋夹

4—小玻杯及棒状玻塞 5—反应室 6—反应室外层

7—橡皮管及螺旋夹 8—冷凝管 9—蒸馏液接收瓶

图8-7 消化炉（配套消化管）

3.试剂

（1）硼酸溶液（20g/L）称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL。

（2）氢氧化钠溶液（400g/L）称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。

（3）0.0500mol硫酸标准滴定溶液或0.0500mol/L盐酸标准滴定溶液。

（4）甲基红乙醇溶液（1g/L）称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（5）亚甲基蓝乙醇溶液（1g/L）称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（6）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（7）A混合指示液 2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

（8）B混合指示液 1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

四、实验步骤

（1）试样制备

①称取充分混匀的固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g（当于30～40mg氮），精确至0.001g，移入干燥的消化管中。

②在消化管中加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，轻摇后放在消化炉中进行消化（技能：消化炉的使用），待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1h。同时做试剂空白试验。

③取下消化管放冷，小心加入20mL水，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗消化管，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

（2）安装定氮蒸馏装置 按图8-6装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内（烧瓶）装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。

注：仪器安装前的各部件洗涤：仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%氢氧化钠溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次。

（3）仪器管道洗涤 仪器使用前，全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸汽洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸汽洗涤，不得少于3次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。洗涤方法如下所述。

①沿漏斗加入蒸馏水约10mL进入反应室，盖紧小玻杯及棒状玻塞（图8-6中4）；

②立即用螺旋夹加紧废液排出口橡皮管（图8-6中7），即关闭废液排放管上的开关，使蒸汽进入反应室，反应室内的水由于受热迅速沸腾，蒸汽进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个烧杯接收冷凝水。冷凝水连续蒸煮5min，停止加热。冲洗完毕，夹紧蒸汽发生器与收集器之间的连接螺旋夹（图8-6中3），由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到汽水反应室中（图8-6中5与6的夹层），此时方可打开废液排出口夹子（图8-6中7）放出废液。上述方法清洗2～3次，仪器即可供测试样使用。

（4）试样消化液的蒸馏和吸收

①试样接收瓶的准备：取洁净的试样接收瓶（图8-6中9），向接受瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1～2滴A混合指示剂或B混合指示剂，并使冷凝管的下端插入液面下。

②吸收：根据试样中氮含量，准确吸取2.0～10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室；以10mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞；将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并水封；夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。

尽快以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，如用A混合指示液，终点颜色为灰蓝色；如用B混合指示液，终点颜色为浅灰红色。同时做试剂空白。

（5）自动凯氏定氮仪法 称取充分混匀的固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g（相当于30～40mg氮），精确至0.001g，至消化管中，再加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420℃之后，继续消化1h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加入50mL水，于自动凯氏定氮仪（使用前加入氢氧化钠溶液，盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A或B的硼酸溶液）上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。

五、结果与讨论

试样中的蛋白质含量按式（8-16）进行计算：

式中 X——样品中蛋白质的含量，g/100g；

V₁——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，mL；

V₂——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；

c——硫酸或盐酸标准溶液的物质的量浓度，moL/L；

0.014——1.0mL硫酸或盐酸标准溶液1相当于氮克数，g；

m——试样的质量，g；

V₃——吸取消化液的体积，mL；

F——蛋白质的系数，各种食品中氮转换系数；

100——换算系数。(www.xing528.com)

蛋白质含量 ≥1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

注：当只检测氮含量时，不需要乘蛋白质换算系数F。

精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

六、注意事项

（1）确保所用试剂溶液用无氨蒸馏水配制。

（2）在消化过程中硫酸钾、硫酸铜的作用。

①硫酸钾：在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度，加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。另一方面随着消化过程硫酸不断地被分解，水分逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机物的分解。因此应该注意硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢氨也会分解，放出氨而造成损失。

实验中除使用硫酸钾外，也可以用硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但使用效果不如硫酸钾。

②硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中除使用硫酸铜外，还可以用氧化汞、汞、硒粉等作为催化剂，但考虑到效果、实验成本及环境污染等多种因素，实验中应用最广泛的是硫酸铜，使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂，以加速有机物的氧化分解。

实验过程中待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜生成时，溶液就呈现清澈的二价铜的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及在消化液蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

（3）试样中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。

（4）当试样消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL后再继续加热消化。

（5）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量，试样中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。

（6）一般消化至消化液呈透明后，继续消化30min即可。但对于含有特别难以氨化的氮化合物的试样，如含有赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等的试样时，需适当延长消化时间。

（7）在蒸馏过程的装置不能漏气，否则造成氨的泄漏，造成误差。

（8）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。蒸馏时加50%氢氧化钠，如果氢氧化钠量加的不够会产生H₂S，使指示剂颜色变红。

（9）硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。

（10）注意不能断电，否则容易倒吸，造成检验失败。

思考题

1.为什么说用凯氏定氮法测定出食品中的蛋白质含量为粗蛋白含量？

2.在消化过程中加入的硫酸铜、硫酸钾试剂有哪些作用？

3.试述蛋白质测定中，试样消化过程所必须注意的事项，消化过程中试样颜色发生什么变化？为什么？

参考文献

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局．GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

内容二 分光光度法测定食品中蛋白质

一、实验目的

（1）掌握食品中蛋白质的测定方法。

（2）掌握比色法测定蛋白质的原理以及操作技术。

二、实验原理

试样中的蛋白质经硫酸消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出试样含氮量，计算蛋白质含量。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

肉与肉制品、乳制品、蛋品、粮食等。

2.仪器

分光光度计、恒温水浴。

3.试剂

（1）氮标准溶液 称量经110℃干燥2h的硫酸铵0.4719g，用少量蒸馏水溶解，定容于100mL容量瓶中，此溶液每毫升相当于含1.0mg氮，使用时配制成1mL相当于2.50μg的氮标准溶液。

（2）空白酸液 称取0.50g蔗糖，加15mL硫酸和5g催化剂（包括硫酸铜0.5g和无水硫酸钠4.5g，二者混匀），与试样一样消化处理后，定容于250mL的容量瓶。使用时吸收此液10mL，加水至100mL于容量瓶定容，作为工作液备用。

（3）磷酸盐缓冲液 称取7.1g磷酸氢二钠、38g磷酸三钠和20g酒石酸钾钠，用400mL水溶解后过滤；另称取35g氢氧化钠溶于100mL水中，冷至室温，一边慢慢地搅拌加入到磷酸盐溶液中，加入水稀释至1000mL备用。

（4）水杨酸钠溶液 称取25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200mL水中过滤，加水稀释定容于500mL容量瓶。

（5）次氯酸钠溶液 吸4mL安替福民液，用水稀释至100mL，摇匀备用。

四、实验步骤

（1）标准曲线的绘制 取6个25mL容量瓶或比色管编号，分别准确加入每毫升相当于2.5μg的氮标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，然后分别加空白酸工作液2mL、磷酸盐缓冲液5mL，稀释至总体体积至15mL，分别加水杨酸钠5mL，36～37℃恒温水浴中加热15min，取出分别加入次氯酸钠2.5mL，再在36～37℃水浴15min，取出后加水至刻度线，马上在分光光度计上于660nm下进行比色，根据测得的吸光度绘标准曲线。

（2）试样处理 精密称取0.20～1.00g试样移入干燥的100或500mL定氮瓶中，加入15mL硫酸和5g催化剂（0.5g硫酸铜，4.5g无水硫酸钠），稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的电炉石棉网上。在毒气柜内小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加水，定容于250mL容量瓶。

（3）试样测定 准确吸取上述消化溶液10.0mL，定容于100mL容量瓶中，准确吸取2.0mL于25mL容量瓶或比色管中，加入5mL磷酸缓冲液；以下操作与标准曲线绘制的步骤相同。

最后以试剂空白为参比液测定样液的吸光度，从前面绘制的标准曲线图上查出其含氮量。

五、结果与讨论

结果计算如式（8-17）、式（8-18）所示。

式中 C——从标准曲线中查出测定样液的含氮量，μg；

K——试样溶液的稀释倍数；

m——试样质量，g；

式中 F——蛋白质系数，可取值6.25，也可查。

六、注意事项

（1）试样消化的要求与凯氏定氮法相同。

（2）当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液放至第二天比色就有变化，增大误差。

（3）当在酸度和试剂适当范围内，反应物的显色和温度有关，实验时应严格控制反应温度。

（4）这种方法测定结果基本与凯氏定氮法一致。

思考题

1.蛋白质测定的结果计算为什么要乘以蛋白质系数？

2.比色反应测定蛋白质的特点及注意事项有哪些？

参考文献

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局．GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.