实验十六乳检验及酸马乳制作优化方案

一、实验目的

（1）掌握原料乳验收要点，掌握乳的密度、酸度、酒精试验和乳中抗菌物质的检验方法。

（2）熟悉酸乳的生产工艺，掌握牛乳酪蛋白胶粒稳定性及影响因素、菌种的活化与驯化方法和酸乳制作原理。

（3）掌握酸马乳制作基本原理及制作过程。

（4）了解传统发酵技术与现代生物培养在酸马乳中的应用。

二、实验原理

1.原料乳的检测

乳的密度：正常乳的密度是乳中各种成分密度的平均值，当乳中比水重的无脂干物质增多时乳的密度会增高，加水时密度则降低。

乳的酸度：由于牛乳含有蛋白质、柠檬酸盐、磷酸盐、脂肪酸、二氧化碳等酸性物质，因此牛乳呈微酸性，其pH为6.5～6.7，这种酸度称为自然酸度。由于微生物的活动，乳糖被分解产生乳酸，使牛乳的酸度升高。这种因发酵而升高的酸度称为发酵酸度。自然酸度和发酵酸度的总和称为总酸度。乳的总酸度越高，乳的热稳定性越低，生产出乳制品的质量也会降低。牛乳的酸度通常用吉尔涅尔度表示，正常乳为16～18°T。

酒精试验是验收原料乳的重要项目。一定数量的正常乳对一定浓度及数量的酒精的脱水作用呈现稳定性，但乳的酸度升高时，乳酪蛋白质因酒精的脱水作用而产生凝集作用。

热稳定性试验（煮沸试验）能有效地检出高酸度乳。乳的酸度升高时，变得不稳定，达到一定酸度时，加热煮沸有絮状或凝固现象发生。

牧场内经常应用抗生素治疗乳牛的各种病症，因此凡经抗生素治疗过的乳牛，其乳中在一定时期内仍残存着抗生素。氯化三苯四氮唑（TTC）试验是用来测定乳中有无抗生素残留的较简易的方法。

2.酸乳制作

（1）酪蛋白胶粒的不稳定性 酪蛋白是以酪蛋白磷酸钙络合物的胶粒状态存在于乳中的。在乳品工业中，很多工艺过程与这种酪蛋白体系的变化有关，特别是在受热、盐类、酸、凝乳酶等作用后，对粒子的凝聚具有重要关系，乳中的酪蛋白酸盐—磷酸盐粒子与乳浆之间保持着一种不稳定的平衡关系。酪蛋白在溶液中主要以其本身的电荷保持稳定状态，其与镁和钙二价离子牢固地结合，因此对周围的盐类、离子、pH与酸度等环境的变化非常敏感。

（2）酪蛋白的酸凝固 酪蛋白磷酸盐胶粒对pH的变化非常敏感。当脱脂乳加酸调节pH时，酪蛋白胶粒中的钙、磷酸盐逐渐游离出来，到pH达到酪蛋白等电点4.6时，乳中沉淀析出的蛋白质就是酪蛋白。

牛乳因微生物污染，产生的自然酸败现象，也会使酪蛋白凝固。这主要是乳糖在微生物作用下生成乳酸的机制，pH下降到酪蛋白的等电点时就会出现絮状沉淀。这种发酵是杂菌共同作用的结果，代谢途径复杂，产物杂异，使产品不能食用。利用纯的乳酸菌培养发酵牛乳制作酸牛乳及其他发酵乳制品就是一个典型例子，这被认为是乳酸发酵过程。

（3）酸乳发酵剂菌种的共生作用

①酸乳发酵剂的主要作用

a.分解乳糖产生乳酸。

b.产生挥发性的物质（如丁二酮、乙醛等），使酸乳具有典型的风味。

c.具有一定的降解脂肪、蛋白质的作用，使酸乳更利于消化吸收。

d.酸化过程抑制了致病菌的生长。

②酸乳发酵剂常用菌种

a.传统菌种：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）。

b.其他菌种：

产香菌种：嗜热链球菌，乳脂明串珠菌和丁二酮乳酸链球菌，双乙酰链球菌。

产维生素的菌种：双歧杆菌，谢氏丙酸杆菌（B₁₂）。

具有保健作用的菌种：双歧杆菌，干酪杆菌，嗜酸乳杆菌。

c.在牛乳发酵前首先要制备发酵剂。发酵过程可以用1种菌，也可以用2种以上的菌作发酵剂，常将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组合起来应用。发酵剂的制备分三个阶段，即乳酸菌纯培养物、母发酵剂和生产发酵剂。

③酸乳发酵剂菌种的共生作用，见图6-5。

图6-5 牛乳中乳酸菌发酵的共生作用

将两种微生物混合培养比分别单独培养时生长得好，这种现象称为共生。若将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组合起来应用，则乳的凝固时间比单一发酵剂短，40～45℃培养，凝固时间只需2～3h，而使用单一发酵剂必须经数小时或更长时间才能凝乳。

保加利亚乳杆菌可从酪蛋白中将多种氨基酸游离出来，促进嗜热链球菌生长，使继代时间大大缩短，菌数很快增加。在开始培养第1小时后，嗜热链球菌数可达3～4倍。此后，由于受到乳酸的影响，嗜热链球菌生长减慢，保加利亚乳杆菌菌数与其逐渐接近。

嗜热链球菌产生的甲酸可促进保加利亚乳杆菌生长。如果对乳进行强烈加热，例如，90℃，30min，乳中会产生相当量的甲酸。但在发酵乳制作过程中，乳的加热处理并不十分强烈，所以不能产生足够的甲酸。在这样的条件下，甲酸只能由嗜热链球菌产生。含有大量甲酸的强烈加热牛乳，例如灭菌乳，具有改变乳酸球菌和乳酸杆菌比例的作用。在用于制作发酵乳的杀菌乳（90℃加热5min或85℃加热20～30min）或灭菌乳[超高温瞬时灭菌（UHT）]中能保持嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的最佳比率（1∶1～2∶1）。

3.酸马乳制作

制酸乳的原料主要是牛乳和酸乳曲种，但也用羊乳、驼乳做原料。酸乳曲种称为活酸乳（核仁格，Horenge），在牧区制曲种非常有讲究，一般找个干净的布袋放少许酒曲和鲜乳进行搅拌或在少许半生不熟的蒙古米子和黏米上加一点白酒，上面再加刚挤的鲜乳或初乳，倒进干净的容器内用干净的布裹好口放置于15℃以上的环境中进行发酵24h，发酵后的东西叫酸乳曲种。在每年新奶子下来后，没有曲种的人家要向别人请曲种。酸马乳又称马奶酒，蒙古语中称琦葛（Qigee），意为“发酵马奶子”。酸马乳是含有乙醇等风味物质和乳酸的发酵制品。它是以新鲜马乳为原料，利用天然发酵剂和传统发酵技术发酵而制成的一种营养价值很高的具有浓厚民族特色的乳酸菌保健饮料。做酸马乳要先进行发酵制曲种。培养酸马乳曲种的方法与普通酸乳曲种的方法差不多，用牛乳培养的酸乳曲种里加凉马乳，或者在马乳里加少许白酒不停地搅拌，在22℃环境里放置5～7d就会发酵成熟。一般要求初曲种的发酵能力必须强。根据现代科学实验分析，确认酸马乳中含有多种有益于人体的有效成分，如糖、蛋白质类、脂肪、维生素类，还有氨基酸、乳酸、酶、矿物质以及芳香性物质和微量酒精等。高血压、瘫痪、肺结核、慢性胃炎、十二指肠溃疡、肠结核、细菌性痢疾、糖尿病等疾病的患者应经常食用。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

牛乳、砂糖等。

菌种：嗜热嗜酸链球菌、保加利亚乳杆菌和混合菌种（工作发酵剂）。

2.仪器

天平、烧杯、150mL三角瓶、25mL碱式滴定管、移液管、玻璃试管（10、20mL）、250mL量筒、乳稠计、温度计、吸管（1、2、25mL）等。

乳瓶、煤气灶、不锈钢锅、发酵罐、恒温培养箱、均质机、塑料箱。灭菌脱脂乳培养基。

3.试剂

95%乙醇、乙醇溶液（68%、70%、72%）、0.5中性酚酞溶液0.1mol/L氢氧化钠标准溶液、4%氯化三苯四氮唑水溶液。

四、实验步骤

1.原料乳的检测

验收原料乳时除根据标准进行感观指标的检验外，还要进行理化性质、微生物方面的检查。

（1）乳的密度通常用牛乳密度计（或称乳稠计）来测定。乳稠计上刻有15～45的刻度，以°来表示。正常乳为30°。每加10%的水约降低3°。乳的密度随温度而变化。在10～25℃范围内，温度每增加或减少1℃，密度则减少或增大0.2°。因此，当乳温达到20℃后，每提高1℃，密度应加0.2°，反之应减去0.2°。

（2）牛乳的酸度其测定方法一般是用0.1mol氢氧化钠滴定10mL乳品，用0.5%酚酞为指示剂，当被滴定样品呈微红色时所消耗的氢氧化钠的体积数乘以10即为100mL乳的酸度。

（3）酒精试验 一般用68%～70%的酒精与等量的牛乳相混合，若呈现稳定，说明牛乳的蛋白质稳定，牛乳的酸度符合原料乳的要求。牛乳对酒精的稳定性越高，牛乳的热稳定性也越好。此外，酒精试验还可以检出乳房炎乳、盐类不平衡及混入钙等异常乳。

（4）热稳定性试验 将牛乳（取5～10mL乳于试管中）置于沸水中或酒精灯上加热5min，如果加热煮沸时有絮状或凝固现象发生，则表示乳已不是新鲜的、酸度在20° T以上、或混有高酸度乳、初乳等。

（5）乳中抗菌物质的检验 乳中有无抗菌物质，常用氯化2，3，5—三苯基四氮唑法检验（TTC法）。

将检样（9mL）（以不含抗菌物质的脱脂乳为对照）于80℃恒温水浴中保持5min杀菌，然后冷却至37℃。向试管中加入试验用稀释菌液（嗜热链球菌）1mL，充分混合后于37℃的条件下培养2h，然后各加入0.3mL TTC试剂，继续培养5min，如果样品液与对照液一样出现红或桃红色，说明无抗菌物质存在；若为无色，说明有抗菌物质存在。

菌种：嗜热嗜酸链球菌。

4%氯化三苯四氮唑水溶液：装褐色瓶内于7℃冰箱保存，临用时1∶5稀释。

（6）细菌数的测定 一般直接、快速的测定方法为直接计数法。步骤如下所述。(www.xing528.com)

①测直径在显微镜下用测微尺测出油镜视野的直径（r）。

②涂片载玻片上用玻璃刀或用蜡笔划1cm²的方格，用微量吸样器吸样并将之滴到载片的方格中，用接种针将样品涂匀，然后在酒精灯火焰上干燥（40～50℃）。

③脱脂干燥后将玻片置于二甲苯中脱脂1～2min，取出沥净晾干，再浸入95%酒精1～2min，除去二甲苯。

④染色用骆氏美蓝染色5min，水洗、干燥。然后镜检10～15个视野，计所见细菌数。

2.酸乳的制作

酸乳的制作如图6-6所示。

图6-6 凝固型、搅拌型和饮用型酸乳的生产步骤方框图

（1）原料乳的质量要求 生产酸乳的原料乳必须是高质量的，要求酸度在18°T以下，杂菌数不高于50万CFU/mL，总干物质含量不得低于11.5%。不得使用病畜乳，如乳房炎乳和残留抗菌素、杀菌剂、防腐剂的牛乳。

（2）辅料

①脱脂乳粉（全脂乳粉）：用作发酵乳的脱脂乳粉质量必须高，无抗生素、防腐剂。

脱脂乳粉可提高干物质含量，改善产品组织状态，促进乳酸菌产酸，一般添加量为1%～1.5%。

②稳定剂：在搅拌型酸乳生产中，通常添加稳定剂，稳定剂一般有明胶、果胶、琼脂、变性淀粉、CMC及复合型稳定剂，其添加量应控制在0.1%～0.5%。凝固型酸乳也可以添加稳定剂。

③糖及果料：一般用蔗糖或葡萄糖作为甜味剂，其添加量可根据各地口味不同有差异，一般以6.5%～8%为宜。

果料的种类很多，如果酱，其含糖量一般在50%左右。

果肉主要是粒度（2～8mm）的选择上要注意。

果料及调香物质在搅拌型酸乳中使用较多，而在凝固型酸乳中使用较少。

（3）配合料的预处理

①均质。

②热处理：热处理可杀灭原料乳中的杂菌，确保乳酸菌的正常生长和繁殖同时可钝化原料乳中对发酵菌有抑制作用的天然抑制物，而且热处理可以使牛乳中的乳清蛋白变性，以达到改善组织状态，提高黏稠度和防止成品乳清析出的目的。

原料乳热处理可在90～95℃下保持5min。热处理后的乳马上冷却到接种温度。

（4）接种 接种量要根据菌种活力、发酵方法、生产时间的安排和混合菌种配比的不同而定，一般为2%～4%。加入的发酵剂应事先在无菌操作条件下搅拌成均匀细腻的状态，不应有大凝块，以免影响成品质量。

（5）灌装 可根据要求选择玻璃瓶或塑料瓶，在装瓶前需对玻璃瓶进行蒸汽灭菌。

（6）发酵 用保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合发酵剂时，温度保持在41～43℃，培养时间2.5～4.0h（2%～4%的接种量）。

达到凝固状态时即可终止发酵。一般发酵终点可依据如下条件来判断：

①滴定酸度达到80°T以上。

②pH低于4.6。

③表面有少量水痕。

④倾斜酸乳瓶或杯观察凝固状态。

（7）冷却 发酵好的凝固酸乳，应立即移入0～4℃的冷库中，迅速抑制乳酸菌的生长，以免继续发酵而造成酸度的升高。在冷藏期间，酸度仍会有所上升，同时风味成分双乙酰含量会增加。

3.酸马乳的制作

（1）玻璃瓶等消毒灭菌 玻璃瓶在灭菌器内灭菌0.5h，如用蒸锅灭菌需45min，接种室内需紫外线灭菌50min，接种工具在高压蒸汽灭菌器内灭菌30min。

（2）鲜乳灭菌 鲜马乳用65℃ 加热杀菌30min。杀菌完都冷却为20～22℃。无论采用哪种方法以不破坏鲜乳原有营养成分为佳，灭菌后冷却。在灭菌前或灭菌过程中最好除去上层油脂，使牛乳脱脂。

（3）发酵剂复活 酸马乳的品质与发酵剂有着直接的关系。酸马乳发酵剂中含有保加利亚乳酸杆菌、乳酸球菌、酵母菌等。使用时把发酵剂浸泡于30℃的去脂消毒牛乳或羊乳中，使菌种复活。复活之后的发酵剂中，少量添加20～22℃的马乳，不断地搅拌，使其充分混合，还可以从中提取一部分再制备母发酵剂。

（4）接种 马乳与发酵剂混合之后要捣3000～4000次，酸马乳中富集气体时温度相对下降，酸度提高，乳酸菌的生长繁殖减慢，而酵母菌的生长繁殖加速。按牧民的经验，发酵好的酸马乳（乙醇发酵为主）酸度在100～110° T的酸马乳中再添加占酸马乳总量1/3～1/4的消毒冷却马乳，使其在相对冷环境中发酵，控制乳酸的生成量，为乙醇等风味物质的形成创造有利条件。如果酸马乳中有气泡或瓶盖上鼓或有辛辣味及其他异味，说明鲜马乳在发酵过程中已被杂菌污染，不能食用。如在室温下放置超时，乳凝很少、乳清分离，甚至不乳凝，会出现大量悬浮物并出现臭味，说明菌种衰退严重或菌种已被杂菌污染，应停止使用。

五、结果与讨论

（1）将原料乳的检测结果记录在表6-28。

表6-28 原料乳的检测结果记录表

（2）酸乳的制作 对本组制作的酸乳进行感官检验，并与其他组进行对比。

六、注意事项

（1）制备发酵剂时应严格无菌操作，防止杂菌污染影响发酵剂质量。

（2）发酵结束后应迅速降低发酵乳的温度，防止过度产酸，影响产品口感。

（3）制备酸马乳的操作技术，其目的就是使乙醇与乳酸保持适当的比例。美味可口的酸马乳通常应当是乙醇含量突出，如乳酸量高于乙醇量，则酸过重而发起苦味，这样的酸马乳在贮存期间很容易变质。

（4）在整个过程中要注意无菌操作。

思考题

1.原料乳验收主要要检验哪些方面？如何进行原理为何？

2.酸乳的制作中可能出现得的质量问题主要为那些？如何进行质量控制？

3.本实验涉及了你所学习过的那些方面的理论知识？

4.酸马乳可用哪些发酵剂？有何特点？

5.酸马乳制作过程最重要的环节是什么？

参考文献

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