茶多酚是一种稠环芳香烃，可分为黄烷醇类、羟基- [4]—黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以儿茶素最为重要，占多酚类总量的60%～80%；儿茶素类主要由EGC、DLC、EC、EGCG、GCG、ECG等几种单体组成。茶多酚在茶叶中的含量一般在20%～35%。在茶多酚中各组成分中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主。儿茶素类物质的含量占茶多酚总量的70%左右。茶多酚在pH4～8稳定。遇强碱、强酸、光照、高热及过渡金属易变质。最高耐热温度在1.5h内，可达250℃左右，在三价铁离子下易分解。
一、实验目的
（1）掌握水萃取法提取茶多酚的方法。
（2）掌握聚酰胺树脂吸附柱层析分离茶多酚的操作技术。
（3）掌握硅胶G板薄层层析法检测茶多酚的成分的操作技术。
（4）能够熟练使用高效液相色谱工作站分析检测茶多酚的成分和纯度。
（5）能够生产出符合质量要求的茶多酚。
二、实验原理
茶多酚，又名茶单宁、茶鞣质，是由茶中提取出来的一类多羟基酚类物质，它是茶叶中的主要有效成分之一。茶多酚易溶于热水，水溶液呈酸性；可溶于甲醇、乙醇、丙醇、冰醋酸、乙酸乙酯，微溶于油脂，难溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等非极性溶剂；耐热性和耐酸性较好。
从萃取液中通过聚酰胺柱，用水洗去茶多糖，再用乙醇将醇溶各组分（包括茶多酚、咖啡因）洗脱，收集茶多酚，提高其纯度。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
干燥、干净的茶叶。
2.仪器
回流提取装置、压滤机、旋转蒸发器、烘箱、循环水泵、硅胶G粉、层析缸、微量点样器、量筒。
离心机、冷冻干燥机、层析柱、真空泵、高效液相色谱仪（HPLC）、超声波清洗仪。
3.试剂
（1）乙醇、聚酰胺树脂、绿原酸、单宁酸、间苯三酚、焦性没食子酸、正丁醇、乙醇、三氯化铁、铁氰化钾、乙酸乙酯、甲醇、甲酸。
（2）标准溶液（乙酸乙酯做溶剂）0.01mol/L绿原酸、0.005mol/L单宁酸、0.01mol/L间苯三酚、0.01mol/L焦性没食子酸。
（3）展层剂 正丁醇∶乙醇∶水=2∶1∶2。
（4）显色剂0.5%三氯化铁和0.5%铁氰化钾，体积1∶1。
四、实验步骤
1.操作流程
操作流程如图4-9所示。
图4-9 茶多酚分离纯化及成品检验
2.操作要点
（1）聚酰胺树脂吸附层析柱的准备预处理方法是水泡，用1mol/L的NaOH、HCl淋洗，每次都用水洗至中性，然后再用95%乙醇洗至无色。
（2）茶多酚的制备
①浸取：将干净、干燥茶叶粉碎至30～40目，投入回流提取器内，加入去离子水，加热，搅拌，温度控制在80～90℃，微沸提取30～60min，过滤，得滤液；滤渣返回提取釜，加水重复提取，每次按干茶叶质量20倍左右加水，总共提取3次。收集3次萃取过滤液，最后一次需滤干，并用少量水淋洗，洗水与滤液合并，备用。收集滤渣，供综合利用。
②浓缩：水萃取液体积大、浓度低，移送至旋转蒸发器内，低压状态下蒸去部分水，然后在离心机上离心，除去固体杂质，取上清液用于层析，混浊部分则与未滤液混合再过滤。
③聚酰胺柱层析：将上述茶叶浸取浓缩液缓慢注入柱中，直至与树脂面齐平，停留一定时间令充分吸附，然后放出。浸取液通过吸附柱的流出速度系根据树脂装量和浸取液浓度而定。
用去离子水淋洗吸附柱至流出液无色再用乙醇为脱附剂，按30%、60%、80%浓度进行梯度洗脱（控制洗脱液流出速度），直至流出液近无色为止。分别收集水洗液和醇洗液，水洗液用于回收茶多糖。(www.xing528.com)
④浓缩：乙醇洗脱液送旋转蒸发器中，减压蒸发（回收乙醇循环使用），得浓缩物。
⑤干燥：把浓缩物送入冷冻干燥机内干燥，得成品茶多酚。
（3）产品成分检测
①薄层层析法检测
a.硅胶G薄板的制备：制板用的玻璃板应平整光滑，预先用洗液或其他洗涤剂洗净，干燥后备用。称取硅胶G粉3g，加0.1mol/L硼酸溶液9mL，于研钵中充分研磨，待硅胶变稠、发出如脂肪光泽时，倾入涂布器中，均匀涂布在玻璃板上，可铺10cm×15cm薄板1块。铺层后的薄板置于100℃烘箱中烘干，取出后放在干燥器中备用，也可在室温下自然干燥24h，用前放入110℃烘箱中活化30min。
b.取制备的茶多酚0.01g溶于20mL乙酸乙酯中。
c.点样：取活化过的硅胶G板，在距底边2cm水平线上确定5个点，相互间隔约1.5cm，其中4个点分别点上绿原酸、单宁酸、间苯三酚和焦性没食子酸溶液，另一个点点样品茶多酚溶液。用内径约1mm管口平整的毛细管吸取酚溶液，轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径不应超过2～3mm，用吹风机冷风吹干，重复滴加几次。
点样是薄层层析中的关键步骤，适当的点样量和集中的原点，是获得良好色谱的必要条件。点样量太少时，样品中含量少的成分不易检出；点样量过多时，易拖尾或扩散，影响分离效果。糖的硅胶G薄层层析点样量一般不宜超过5μg。点样完毕使斑点干燥即可展层。
d.展层：根据样品的极性及其与展层剂的亲和力选择适当的展层剂。本实训选用正丁醇∶乙醇∶水=2∶1∶2为展层剂，用前临时配制。展层在密闭器皿中进行。为了消除边缘效应，可在层析缸内壁贴上浸透展层剂的滤纸条，以加速缸内蒸汽的饱和。将薄板点有样品的一端浸入展层剂，注意切勿使样品原点浸入溶剂，盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端1～2cm时，即可停止展层，取出放在室内自然干燥或用吹风机吹干。
e.显色：显色是鉴定物质的重要步骤。纸层析用的显色剂一般均可用于薄层层析，无机吸附剂薄板还可使用腐蚀性显色剂，如用5%～50%的硫酸乙醇或水溶液喷雾，在130℃下烘烤10min，糖呈现黄—棕—黑色。本实训采用三氯化铁—铁氰 化钾显色剂溶液喷雾法，喷出细雾使薄板均匀湿润，注意切勿喷出点或线状溶液，然后于85℃烘箱中烘30min，各种酚即呈现出不同的颜色。
f.结果计算：准确量出原点至溶剂前沿和至各色斑中心点的距离，计算出它们的Rf值（Rf=原点至斑点中心的距离/原点至展开剂前沿的距离）。根据标准酚的颜色和办值，鉴定出样品提取液中酚的种类，并绘出层析图谱。
②高效液相色谱检测
a.样品处理：取40g制备的茶多酚于250mL烧杯中，捣碎成粉末状，加入60%（体积分数）乙醇200mL；超声30min后，适当冷却后用普通定性滤纸过滤，过滤后得到翠绿色溶液，滤液冷却后用0.45pm微孔滤膜过滤后备用。
b.色谱条件：Waters XBridge C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）。
梯度洗脱程序按0mim时18A、85B；10mim时，18A、82B；60mim时，30A、70B程序线性递增流动相A的体积分数恒定在15（即处于初始状态）平衡15min，以便下一次进样。
检测波长280nm；流速1.0mL/min；柱温40℃。
流动相A：甲醇、甲酸以体积比99.7∶0.3混合的溶液；流动相B：水、甲酸以体积比99.7∶0.3混合的溶液。
c.儿茶素对照品溶液：称取儿茶素对照品混合物20.0mg，用水溶解后定容至10mL容量瓶中，摇匀，即得总浓度为2.000g/L。对照品混合储备液。
五、结果与讨论
参照《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313-2018）中处理色谱数据并计算茶多酚多量。
六、注意事项
因茶多酚易于氧化，所以加热时间不宜过长。
思考题
1.在提取茶多酚过程中，提取温度和提取时间对提取率有无影响？
2.提取茶多酚除有机溶剂萃取外，还可采取什么方法？
3.硅胶G薄层层析实验中引起样品点拖尾的因素有哪些？
4.当固体相选定后，为达到理想的分离效果，选择展层剂的原则是什么？
[1]国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会．GB/T 8313-2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[S].北京：中国标准出版社，2018.
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