葡萄皮花青素测定及稳定性研究

一、实验目的

（1）掌握分光光度法测定葡萄皮中花色素的原理与方法。

（2）了解花青素的性质，特别是要掌握影响花青素颜色变化的主要因素，从而提出在加工过程中如何利用花青素的这些特性为生产实践服务。

二、实验原理

花青素（anthocyanidin），又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物，也属于多酚类物质，花色素溶于水、甲醇、乙醇、丙二醇，不溶于油脂，色调随pH而变化：酸性时呈红至紫红色，碱性时呈暗蓝色，铁离子存在下呈暗紫色。从葡萄皮中分离出的花色素晶体多为针形，它的提取物浓缩物是红至暗紫色液状、块、粉末状或糊状物质。深色花色素有两个吸收波长范围，一个在可见光区，波长为465～560nm，另一个在紫外光区，波长为270～280nm。花色素颜色深浅与花青素含量成比例，用比色法即可进行测定，方法简单易行。

花青素和花色苷的化学性质不稳定，常常因环境条件的变化而改变颜色，影响变色的条件主要包括pH、氧化剂、酶、金属离子、糖、温度、防腐剂和光照等。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

葡萄皮。

2.仪器

试管、坩埚、电炉、分光光度计、酸度计。

3.试剂

所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。

（1）盐酸、无水乙醇、氢氧化钠、FeCl₃、ZnSO₄、CaCl₂均为分析纯级。

（2）葡萄果皮。

（3）葡萄糖、果糖、蔗糖、维生素C、苯甲酸钠均为食品级。

四、实验步骤

（1）样品处理

①葡萄皮中花色素的完全提取：称取葡萄皮1g，液氮研磨成粉末，加入1%盐酸—甲醇提取液10mL，室温下于暗处浸提2次，每次2～3h，合并滤液。

②葡萄皮中花色素的水提液制备：称取葡萄皮1g，液氮研磨成粉末，加入去离子水（用盐酸调pH 2）提取液10mL，室温下于暗处浸提1h，过滤，用去离子水（用盐酸调pH 2）洗涤3次，合并滤液定容至50mL。

（2）葡萄果皮花色素光谱特性测定 利用葡萄皮花色素的盐酸—无水乙醇提取液及水提取液在400～600nm波长范围内测定吸光度值，绘制其特征吸收光谱曲线。

（3）葡萄果皮花色素化学稳定性测定 获得花色素提取液，通过真空旋转蒸发仪浓缩至膏状（30℃加热），加去离子水稀释成一定浓度，并调节pH 2；以此溶液为试样，研究pH、外界光照、温度、金属离子（Fe³⁺、Zn²⁺、Ca²⁺）、糖类（葡萄糖、果糖、蔗糖）、维生素C、食品添加剂苯甲酸钠等因素对花色素化学稳定性的影响。

pH对葡萄果皮花色素稳定性影响：溶液的pH用1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH在2～12，过30min后测定溶液吸光度值（由于加入盐酸和氢氧化钠水溶液的量很少，色素溶液的浓度及吸光度值的变化可以忽略不计）。

光照对花色素稳定性影响：将色素溶液装入密闭的无色透明玻璃试管中，光照分为室内自然光、室外阳光和室内避光；实验进行期间天气晴朗，室内自然光放置是指白天在室内不遮光处，晚上不进行任何光照；室外阳光下放置时间为8：00～16：00。定时观察色素溶液颜色的变化并测定其吸光度。

温度对花色素稳定性影响：色素溶液在20、40、60、80、100℃不同温度条件下（对照温度为室温25℃）下将色素溶液用密闭试管加热30min，加热完后放在不同光照条件下，隔一定时间测定溶液吸光度值。溶液加热后要补充因蒸发损失的水分。

金属离子对色素的影响：色素溶液中加入0.005、0.01、0.015、0.02g/mL不同量的FeCl₃、ZnSO₄、CaCl₂，蒸馏水作对照，将色素溶液用密闭试管置于室内自然光下60h（2.5d），隔12h测定溶液吸光度值。

糖类（果糖、蔗糖、葡萄糖）对花色素稳定性的影响：色素溶液中加入0.01、0.05、0.1、0.15、0.2g/mL不同量果糖、蔗糖、葡萄糖，以试剂空白的色素液作参比，将色素溶液用密闭试管在室内自然光下放置60h，每隔12h测定溶液吸光度值。

维生素C对花色素稳定性的影响：色素溶液中加入2、4、10、15、20g/mL不同量维生素C，因此在室内自然光下放置的时间较短，将色素溶液用密闭试管在室内自然光下放置，4h，每隔0.5h测定溶液吸光度值。

苯甲酸钠是食品加工中常用的防腐添加剂，色素溶液中加入0.5、1、1.5、2、3g/mL不同量苯甲酸钠，以试剂空白的色素液作参比，将色素溶液用密闭试管在室内自然光下放置60h，每隔12h测定溶液吸光度值。

以上实验都是在水提取液最大吸收波长处测得溶液吸光度值，每处理设3个重复实验。(www.xing528.com)

五、结果与讨论

（1）葡萄皮中花色素含量计算

式中 A——最大吸收波长处吸光度值；

V——定容体积，L；

1000——克换算成毫克扩大的倍数；

455.2——矢车菊素-3—葡萄糖苷的分子质量，g/mol；

29600——矢车菊素-3—葡萄糖苷的浓度比吸收系数，L/（mol·cm）；

d——比色杯光径，cm；

m——葡萄果皮质量，g。

（2）列表记录以上各种处理花青素颜色的变化（表4-11）

表4-11 实验结果记录表

六、注意事项

（1）酸度计按仪器说明校正。

（2）反应试管应用清洁剂浸泡24h，彻底洗涤干净。

（3）色素溶液应用密闭试管放置。

思考题

1.样品处理时影响花色素含量的因素有哪些？

2.为什么花色素提取溶液要用密闭试管放置？

3.测定葡萄皮花色素的意义何在？

4.根据反应机制讨论如何在食品加工中提高花青素的稳定性。

参考文献

[1]贾赵东，马佩勇，边小峰，等．植物花青素合成代谢途径及其分子调控[J].西北植物学报，2014，34（7）：1496-1506.

[2]王华，李茂福，杨媛，等．果实花青素生物合成分子机制研究进展[J].植物生理学报，2015，51（1）：29-43.

[3]邵婉璐，李月灵，高松，等．光照强度对成熟红颜草莓果实着色和花青素生物合成的影响及可能的分子机制[J].植物研究，2018，38（5）：661-668.

[4]李金星，胡志和，马立志，等．蓝莓加工过程中出汁率及花青素的稳定性[J].食品科学，2014，35（2）：120-125.

[5]任小娜，陈志梅，曾俊，等．黑果枸杞中原花青素提取条件的优化与含量测定[J].食品与发酵工业，2015，41（1）：147-150.

[6]谢兵，周杰，朱树华．新疆红肉苹果发育期间花青素代谢的研究[J].山东农业科学，2015，47（8）：25-29.

[7]杜月娇，贺阳，文连奎．山葡萄花青素超高压提取工艺优化及其组分分析[J].食品科学，2017，38（10）：258-263.