豆乳蛋白中-SH和-S-S基团的检测方法优化

一、实验目的

掌握食品中—SH和—S—S—基团含量的测定方法。

二、实验原理

蛋白质的—SH和—S—S—基团有很高的反应活性，所以其在提高食品功能特性方面起着很重要的作用。面筋、明胶和基于蛋白质的可食用薄层的形成都与—SH基团转变成—S—S—有关。此外，一些食品加工处理如加热、氧化和还原都很有可能导致—SH和—S—S—的相互转换。因此，当研究食品中蛋白质的性质时，常常分析—SH和—S—S—的含量及其变化。目前，最广泛的使用方法是埃尔曼法：二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和—SH反应生成一种黄色物质，它在412nm处有最大吸收峰。对于低浊度的纯蛋白质溶液中—SH含量的测定，这种方法是简单、快速、直接和理想的方法。但是，如果在混浊溶液，如牛乳或豆乳中，直接测定—SH的含量，由于这些溶液的高浊度会使实验结果偏离真实结果。对于包括紫外线分光光度法在内的所有的分光光度法而言，这是个普遍的问题。本实验中，利用丙酮沉淀蛋白质，破坏乳状液体系，然后蛋白质溶解于含有变性剂的（尿素）三羟甲基氨基甲烷—甘氨酸（tris—甘氨酸）缓冲液中，即可测定自由巯基的含量。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

豆乳。

2.仪器

25mL具塞试管、均质机、离心机、分光光度仪、阿贝折光计

3.试剂

（1）Tris缓冲液

缓冲液①：Tris 10.4g、甘氨酸6.9g、乙二胺四乙酸（EDTA）1.2g，加去离子水定容至1L，pH 8.0；

缓冲液②：Tris 10.4g、甘氨酸6.9g、EDTA 1.2g、尿素480g，加去离子水定容至1L，pH 8.0；

缓冲液③：Tris 10.4g、甘氨酸6.9g、EDTA 1.2g、尿素600g，加去离子水定容至1L，pH 8.0。

（2）埃尔曼试剂0.2g DTNB溶解于50mL缓冲液①中。

（3）沉淀蛋白质的12%三氯乙酸（TCA）溶液 每升去离子水中含120g三氯乙酸。

（4）丙酮。

（5）2—巯基乙醇。

四、实验步骤

（1）样品的制备

①制备豆乳：将黄豆于去离子水中（黄豆∶水=1∶10）在5℃浸泡12h。浸泡好的黄豆和水一起均质5min。用200目的尼龙滤袋过滤浆液。滤液（豆乳）备用。

②丙酮处理豆乳：将1mL的豆乳和9mL的无水丙酮混合并搅拌，静置10min，3000r/min离心15min，沉淀用5mL丙酮两次重新浸泡，3000r/min离心15min。沉淀中的丙酮溶剂通过冷气流从离心管中蒸发出去。

沉淀物于5mL的缓冲液①或缓冲液②中溶解，分别用于测定表面—SH含量以及总自由—SH含量。

将1mL豆乳和4mL缓冲液①或1mL豆乳和4mL缓冲液②的混合溶液，分别用来测定表面—SH含量以及总自由—SH含量，作为对照。

（2）—SH基团和—S—S—基团的测定(www.xing528.com)

①自由—SH的测定：将1mL已制备好的豆乳与2mL的缓冲液①或缓冲液②以及0.02mL埃尔曼试剂混合，于25℃反应5min。用分光光度仪在412nm测定吸光度。无豆乳的反应溶液作为空白对照，无埃尔曼试剂的豆乳用于测定浊度。

②蛋白质中总半胱氨酸含量的测定：将0.2mL已制备好的豆乳，1mL缓冲液3和0.02mL 2—巯基乙醇混合，混匀于25℃静置5min，然后加10mL 12%TCA，于25℃静置1h，5000×g离心15min。沉淀用5mL 12%TCA二次重新浸泡，5000×g离心10min。将沉淀溶解在3.0mL缓冲液①中，加0.05mL埃尔曼试剂显色，在412nm测定吸光度。未加埃尔曼试剂的溶液用于测定浊度。

五、结果与讨论

（1）计算 由式（4-1）计算—SH基团和半胱氨酸含量：

式中 A₄₁₂——412nm处吸光度，在显色溶液中，有无DTNB，A₄₁₂无差异；

D——稀释倍数，—SH：D=3.02×5=15.1；总半胱氨酸：D=（3.05/0.2）×5；

C——豆乳中总固形物含量，65rag/mE。

（2）埃尔曼法测定中使用丙酮，能将蛋白质沉淀分离，除去豆乳中的脂肪，破坏了蛋白质与脂肪形成的乳化体系，使大豆蛋白质的混浊度下降。因此，采用—SH和埋藏在分子内部的—SH，而且在测定半胱氨基总量时，丙酮处理可使蛋白质溶液的混浊度进一步降低。

（3）丙酮处理对测定结果无影响。

六、注意事项

注意丙酮有挥发性。

思考题

1.哪些因素影响食品中—SH和—S—S—含量测定的准确性。

2.叙述—SH和—S—S—含量对质构食品的影响？

3.实验中尿素、2—巯基乙醇、TCA各有什么作用？

4.混浊度对—SH含量测定有什么影响？

说明： 本实验译自《食品化学实验手册》（欧仕益，黄才欢，吴希阳．食品化学实验手册[M].北京：中国轻工业出版社，2008）。

参考文献

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