如何控制非酶褐变反应？实验探究及感官分析

一、实验目的

（1）掌握美拉德反应原理。

（2）研究食品成分和食品pH对美拉德反应的影响。

二、实验原理

食品中有很多的反应都能引起褐变，一个是酶促褐变，另一个是非酶褐变。非酶褐变主要有三种类型：①在高温下还原糖（带有一个自由醛基）和氨基引起的美拉德反应，引起褐色、肉色和焦糖化的形成，同时造成氨基酸损失，导致潜在致癌化合物的形成；②焦糖化是蔗糖在非常高的温度（明显高于美拉德反应）下发生的反应，能产生褐色和苦味；③脂肪褐变，过度加热（即油炸）之后脂肪的聚合。在食品加工制造中，美拉德反应是三种褐变中最重要的，它也许会产生期望和不期望的结果。

本实验中，我们将测试不同的成分和加工作条件对褐变的促进及抑制反应，并结合产品进行感官分析。美拉德反应的第一步就是氨基与还原糖的醛基的亲核加成，任何一个氨基都能参与反应，除了赖氨酸的侧链的氨基是一个特殊反应，这个氨基被消除，产物重排形成3—脱氧己酮糖（DH），DH能进一步分解形成羟甲基糠醛（HMF，甜/苦味）。这些反应中的几个二羰基中间产物（尤其是DH）会对其他氨基有很大的影响（除了赖氨酸）。通过斯特勒克（Strecker）方式降解（图4-1），蛋白质分解可形成氨水和醛基（基于反应氨基酸的侧链）。这种醛基常常具有很强的风味挥发性，这种挥发性有时具有坚果和肉的风味特征。

美拉德反应的HMF和其他产物能聚合形成大分子且难以定义的化合物，随着化合物的增加，颜色变为棕黑色，且不溶性增大。

低温可以抑制美拉德反应，这是因为低温可以减少试剂的亲核反应，或者加亚硫酸离子。亚硫酸离子是强亲核试剂，可引入醛基基团形成加成物，而这个加成产物不参与褐变（图4-2）。亚硫酸的反应机制如下：褐变的中间物DH能可逆地与亚硫酸离子键合形成磺酸盐加成物，这个产物DSH不会发生褐变。

图4-1 Strecker降解

亚硫酸离子易挥发出二氧化硫气体，而二氧化硫能引发哮喘，具体使用规定可参考《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）。一些食品允许使用亚硫酸，因为这类食品在加工过程中，亚硫酸会形成气体逸出。尽管R—S^-能进行与亚硫酸相似的亲核反应，但其并没有被广泛接受，作为亚硫酸食品添加剂的替代品。如果，R—S^-能与DH反应，并能克服风味问题，这将是其成为抗美拉德褐变的添加剂。

图4-2 亚硫酸盐对美拉德反应的抑制作用

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

乳清蛋白（WPI）或大豆蛋白（SPI）；曲奇面团。

2.仪器

分光光度仪和比色皿、电炉和水浴锅、烤箱（200℃）、焙烤盘、滤纸、金属箔片、油炸盘和油、小毛刷。

3.试剂

（1）葡萄糖、谷氨酸和赖氨酸溶液（浓度均为0.25mol/L，用50mmol/L磷酸缓冲溶液配制，分别调至pH 6和pH 8）。

（2）乳清蛋白（WPI）或大豆蛋白（SPI），以2%（质量分数）加入水中，用氢氧化钠分别调至pH 6和pH 8。

（3）水解WPI或SPI，以2%（质量分数）加入水中，用盐酸调至pH 3，90℃加热30min，冷却，再用氢氧化钠分别调至pH 6和pH 8。

（4）曲奇面团（4个烧杯）。

四、实验步骤

1.褐变的液体模型

（1）加2mL葡萄糖溶液于比色管中，再加2mL任意氨基酸溶液混合，盖上塞子。

（2）将盛有水的烧杯放在电炉上煮沸，制成沸水浴（烧杯中加入碎片以防止暴沸）。

（3）把试管放入沸水浴中加热，于10、20、40、80和100min分别把试管从水浴中移出，擦干，快速测量吸光值（420nm）。

（4）最后打开盖子，描述香气，和实验初期化合物的气味进行比较。

2.褐变的固体模型

（1）在滤纸上标记两个点，相距约2cm（图4-3）。

（2）在一个标记处加一滴葡萄糖溶液，另一个标记加一滴氨基酸或蛋白质溶液。液体在滤纸上扩散，发生部分重叠。

（3）将滤纸油炸几秒。(www.xing528.com)

（4）把上述滤纸影印或拍摄下放在结果中。

3.焙烤食品的褐变

（1）将生面团分成25g/个，排好放在烤盘羊皮纸上。

（2）用玻璃棒在曲奇面团表面划两条线，将其四等分（图4-4）。

图4-3 美拉德褐变的固体模型

图4-4 焙烤曲奇的美拉德褐变

（3）曲奇饼干的一半涂氨基酸溶液，另一半涂葡萄糖，放置5min使表面晾干。尽量使溶液均匀分布。即：第一个1/4涂葡萄糖和氨基酸溶液，第二个1/4仅涂葡萄糖，第三个1/4仅涂氨基酸，剩下的什么都不涂。尽量使曲奇的每1/4都有3滴每种溶液。在曲奇下的羊皮纸上进行标记，以便于确定哪部分用哪种处理方式。每种蛋白质准备两块曲奇。

（4）将上述曲奇一起焙烤10min，记录其颜色和气味。

五、实验结果

填写表4-1，并分析实验结果。

表4-1 实验结果记录表

注：对照品是其上什么都没涂的曲奇饼干。

六、注意事项

（1）要求学生实验前注意不要吃辛辣食物，不要闻强烈刺激气味。

（2）测定吸光度值要迅速。

思考题

1.在系统模型（溶液和固体），哪一个模型褐变最快，为什么？哪一个不褐变？为什么？与溶液相比，为什么纸褐变更快？是蛋白质水解减少了不同吗？为什么？

2.哪些因素造成模型与真实系统的差异？尤其要考虑曲奇的其他成分可能参与反应或不同的加热方式。

3.pH是如何影响美拉德反应的？

4.你认为哪一种氨基酸或蛋白质先发生美拉德反应？

5.水解蛋白质的褐变反应比完整蛋白质快还是慢？为什么？

说明： 本实验译自《食品化学实验手册》（欧仕益，黄才欢，吴希阳．食品化学实验手册[M].北京：中国轻工业出版社，2008）。

参考文献

[1]Zafer Erbay，Nurcan Koca. Effects of using whey and maltodextrin in white cheese powder production on free fatty acid content，nonenzymatic browning and oxidation degree during storage[J]. International Dairy Journal，2019（96）：1-9.

[2]王鑫，魏婧，马蕊，等．蓝莓果汁贮藏中非酶褐变影响因素研究[J/OL].食品工业科技：1- 10[2019- 06- 27].http://sq.lib.xju.edu.cn：80/rwt/CNKI/http/NNYHGLUDN3WXTLUPMW4A/kcms/detail/11.1759.TS.20190415.1459.046.html.

[3]胡云峰，王娜，李宁宁，等．响应面法优化枸杞非酶褐变产物提取工艺及其抗氧化性研究[J].保鲜与加工，2018，18（4）：66-72.

[4]史海慧，谭秀环，刘静雪．鲜湿面褐变机制及品质改良研究进展[J].粮食加工，2018，43（5）：24-26.

[5]Technology-food technology；findings on food technology reported by investigators at university of Copenhagen（effect of water activity on lipid oxidation and nonenzymatic browning in Brazil nut flour）[J]. Food Weekly News，2018.

[6]Alan G. de O. Sartori，Severino M. Alencar，Deborah H. M. Bastos，et al. Effect of water activity on lipid oxidation and nonenzymatic browning in Brazil nut flour[J]. European Food Research and Technology，2018，244（9）：1657-1663.

[7]陈俊．5—羟甲基糠醛参与的非酶褐变研究[D].广州：暨南大学，2018.