食品中细菌总数与大肠菌群测量实验

一、实验目的

（1）学习并掌握平板菌落计数法测定食品中菌落总数的基本原理和方法。

（2）学习并掌握食品中大肠菌群的最可能数（MPN）计数法。

（3）了解菌落总数测定在食品卫生学评价中的意义及大肠菌群在食品卫生检验中的意义。

二、实验原理

1.食品中菌落总数的测定

食品中菌落总数（aerobic plate count）是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得1g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。在规定的培养条件下所得的结果，通常只包括一群在平板计数的琼脂培养基上能生长发育的嗜中温、需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。

食品中菌落总数的食品安全学意义主要在于：①可作为食品被微生物污染程度的指标；②可用来预测食品可存放的期限。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。如果食品中菌落总数多于10万个，就足以引起细菌性食物中毒；当人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而发生变质时，细菌数大约已达到10⁶～10⁷个/g（mL或cm²），详见表2-1。

表2-1 几种食品变质（能被人的感官察觉）时的菌落总数

平板菌落计数法又称标准平板活菌计数法（SPC），是最常用的一种活菌计数法。即将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的一个单菌落，即菌落形成单位（CFU）。根据每皿形成的CFU数乘以稀释倍数，即可推算出菌样的含菌数。

菌落总数不能区分细菌的种类，也不是所有细菌都能在一种培养条件下生长，所以这并不能表示检测菌样中的所有细菌总数，故有时被称为杂菌数、需氧菌数等。

2.食品中大肠菌群的测定

（1）大肠菌群的定义及范围 根据《食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3-2016）中规定，大肠菌群（coliforms）是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽孢杆菌。它直接或间接来自人与温血动物的肠道，包括肠杆菌科的大肠埃希菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。

（2）大肠菌群的食品安全学意义 早在1892年，沙尔丁格（Schardinger）首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德·斯密斯（Theobold. Smith）指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的。从此，人们开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。大肠杆菌现已被我国和国外许多国家广泛用作食品卫生质量检验的指示菌。

大肠菌群的食品卫生学意义是作为食品被粪便污染的指示菌，食品中粪便含量只要达到10^-3mg/kg即可检出大肠菌群。一般认为，作为食品被粪便污染的理想指示菌应具备以下特征：①存在于肠道内特有的细菌，才能显示出指标的特异性；②在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出；③在肠道以外的环境中，其对外界不良因素的抵抗力大于肠道致病菌或相似；④检验方法简便，易于检出和计数。大肠菌群比较符合以上要求。

肠道致病菌如沙门菌属、志贺菌属是引起食物中毒的重要致病菌，然而对食品经常进行逐批逐件地检验又不可能，鉴于大肠菌群与肠道致病菌来源相同，且一般在外环境中生存时间也与主要肠道病原菌一致，所以大肠菌群的另一个重要食品卫生学意义是作为肠道病原菌污染食品的指示菌。当然食品中检出大肠菌群，只能说明有肠道病原菌存在的可能性，两者并非一定平行存在，但只要食品中检出大肠菌群，则说明有粪便污染，即使无病原菌，该食品仍可被认为是不卫生的。

（3）大肠菌群计数方法 根据GB 4789.3-2016中规定，MPN计数法适用于大肠菌群含量较低的食品中的大肠菌群的计数，平板计数法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

MP N法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法，其原理利用其发酵乳糖、产酸产气的特征，将待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

平板计数法是指大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落，以统计样品中大肠菌群数。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

待测食品样品。

2.仪器

电热恒温培养箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针、玻璃珠、振荡器等。

3.试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、平板计数琼脂（PCA）培养基、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L盐酸溶液。

四、实验步骤

1.食品中细菌总数的测定

（1）检样稀释及培养

①称取25g固体或半固体样品剪碎或磨碎或25mL液体样品，放入含有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min均质1min，制成1∶10的均匀稀释液。

②用1mL无菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL稀释液的无菌试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1∶100的稀释液。

③另取1mL的灭菌吸管，按上述操作顺序制备10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL无菌吸管。

④根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜的稀释度，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL稀释液于无菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入2个无菌平皿内作空白对照。

⑤稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃平板计数琼脂培养基[可放置在（46±1）℃水浴锅内保温]注入平皿15～20mL，并转动平皿使混合均匀。

⑥等琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃恒温箱内培养（48±2）h。水产品（30±1）℃恒温箱内培养（72±3）h。

（2）菌落计数

①可用肉眼观察，必要时用放大镜检查或用菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以CFU表示。

②选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

③其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。

④平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

（3）菌落总数的计算方法

①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

②若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（2-1）计算。(www.xing528.com)

式中 N——样品中菌落数

∑C——平板菌落数之和

n₁、n₂——低稀释倍数和高稀释倍数平板个数；

d——第一稀释度。

③若所有稀释度平均菌落数均大于300CFU，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度的平均菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300CFU之间，其中一部分大于300CFU或小于30CFU时，则以最接近30或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

（4）菌落总数的报告 菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数，也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字；若所有平板上蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延；若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效；称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

2.食品中大肠菌群的测定

（1）大肠菌群MPN计数法

①将检样25g（或25mL）放于含有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或无菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000～10000r/min的速度处理1min，做成1∶10的稀释液。样品稀释液的pH应在6.5～7.5之间，必要时用氢氧化钠或盐酸调节。

②用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL稀释液的无菌试管内，振摇混匀，做成1∶100的稀释液。根据对样品污染状况估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品，每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品稀释液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

③乳糖初发酵试验：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量在1mL以上则双料LST肉汤），放入（36±1）℃温箱内，培养（24±2）h观察导管内是否有气泡产生，（24±2）h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至（48±2）h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

④复发酵试验：用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，（36±1）℃培养（48±2）h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

⑤大肠菌群MPN的报告：大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN表（表2-2），报告1g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

表2-2 大肠菌群MPN检索表

注：①本表采用3个稀释度0.1、0.01、0.001g（mL），每个稀释度接种3管。

②表内所检样品如改用 1、0.1和 0.01g（mL）时，表内数字应相应降低 10倍，如改用 0.01、0.001和0.0001g（mL）时，则表内数字应相应提高10倍，以此类推。

（2）大肠菌群平板计数法

①平板计数：选取2～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每平皿1mL，同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照；将15～20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中，旋转平皿，使培养基与样液充分混匀，待凝固后，再加3～4mL VRBA覆盖于平板表层，翻转平板，置于（36±1）℃培养18～24h。

②平板菌落数的选择：选取菌落数在15～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落（如菌落直径较典型菌落小）。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。

③证实实验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，（36±1）℃培养24～48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

④大肠菌群平板计数报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以②中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为1g（mL）样品中大肠菌群数。例如，10^-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上游100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为100×6/10×10⁴=6.0×10⁵CFU/g（mL）。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

五、结果与讨论

（1）将实验测出的样品菌落总数以报表方式报告结果。

（2）根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表，报告1g（mL）样品中大肠菌群的MPN值，并比较两种方法所得的大肠菌群数。

六、注意事项

（1）检样时注意无菌操作。

（2）每次实验需要有阴性对照；稀释样品一定要混匀。

（3）高压灭菌后，排尽倒管中的气体；取出培养基置于冰箱中冷却，效果比较好。

（4）在实际工作中，大肠菌群的产气量不同，若倒管中只有非常少的气体（类似小米粒的气泡）时，可以轻轻摇晃试管，如有气泡沿管壁快速上浮，应考虑可能有气体产生。

思考题

1.食品检验为什么要测定菌落总数？

2.影响菌落总数准确性的因素有哪些？

3.什么是大肠菌群？它主要包括哪些细菌属？

4.为什么要选择大肠菌群作为食品被肠道病原菌污染的指示菌？

5.如果水中有大量致病菌，如痢疾、伤寒、霍乱等致病菌，用本实验方法检测总大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？

参考文献

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[2]沈平，范秀荣，李广武．微生物学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，1999.

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