食品微生物分离纯化实验技术

一、实验目的

（1）学习并掌握食品中微生物的分离与纯化的原理和方法。

（2）建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。

二、实验原理

微生物分离与纯化是指从混杂微生物群体中获得的只含有某一种或某一株微生物的过程，是微生物学中重要的基本技术之一。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于分离微生物的生长条件，如营养成分、pH、温度和氧气等要求，或加入某种试剂使其只利于某种微生物的生长，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板、稀释倾注平板或平板划线等技术完成。但获得的单个菌落并不一定保证是纯培养。纯培养的确定除菌落观察外，还需结合显微镜观察个体形态特征，有些微生物的纯培养需经过多次分离纯化和多种特征鉴定才获得。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

待测食品样品。

2.仪器

电热恒温培养箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针、玻璃珠、振荡器等。

3.试剂

高氏一号培养基、营养琼脂培养基、马铃薯蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基、无菌生理盐水。

四、实验步骤

1.稀释涂布平板法

（1）倒平板 将培养基加热熔化待冷却至50～60℃时，混合均匀后倒平板，每个平皿15～20mL培养基；冷却、凝固。具体操作过程如图2-2。

图2-2 倒平板的操作过程

（2）制备样品稀释液

①称取10g固体或半固体样品剪碎或磨碎或10mL液体样品，放入含有90mL生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min均质1min，制成1∶10的均匀稀释液。

②用1mL无菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL稀释液的无菌试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1∶100的稀释液。

③另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序制备10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL无菌吸管，从而获得10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等不同稀释度的样品溶液。

（3）涂布 将上述配制的固体培养基的平板地面标记上实验所需的稀释度，然后用无菌吸管分别从所需的稀释度的样品稀释液中各吸取0.1或0.2mL，滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌玻璃涂棒放在培养基表面上，将稀释液沿同心圆方向轻轻向外扩展，使之分布均匀。室温静置5～10min。操作示意图如图2-3所示。

图2-3 平板涂布操作图

（4）培养 将高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基平板倒置于28℃培养箱中培养3～7d，营养琼脂培养基平板倒置于37℃培养箱中培养1～2d。

（5）挑取菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少量细胞接种到相应的培养基斜面上，在相应条件下再培养。若发现杂菌，则需继续分离纯化，直至获得纯培养。

2.稀释倾注平板法(www.xing528.com)

（1）制备样品稀释液

①称取10g固体或半固体样品剪碎或磨碎或10mL液体样品，放入含有90mL生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min均质1min，制成1∶10的均匀稀释液。

②用1mL无菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL稀释液的无菌试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1∶100的稀释液。

③另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序制备10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL无菌吸管，从而获得10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等不同稀释度的样品溶液。示意图如图2-4所示。

图2-4 稀释倾注平板示意图

（2）加样及倒平板 分别精确吸取实验所需的稀释度菌液1.0mL加入编好标记的无菌的空平皿中；将培养基加热熔化待冷却至50～60℃时，混合均匀后将其倒入加有稀释液的平皿中，轻轻旋转使培养基与样品稀释液充分混匀，每个平皿放入15～20mL培养基；冷却、凝固。示意图如图2-4。

（3）培养 将高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基平板倒置于28℃培养箱中培养3～7d，营养琼脂培养基平板倒置于37℃培养箱中培养1～2d。

（4）挑取菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少量细胞接种到相应的培养基斜面上，在相应条件下再培养。若发现杂菌，则需继续分离纯化，直至获得纯培养。

3.平板划线分离法

（1）倒平板 将培养基加热熔化待冷却至50～60℃时，混合均匀后倒平板，每个平皿放15～20mL培养基；冷却、凝固。

（2）划线 将无菌的接种环挑取上述10^-1的样品悬液一环在平板上划线。常用的划线方法是先在培养基的一边做第一次平行划线3～4条，再转动平皿60°～70°，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，以同样方法，共做四次平行划线（示意图见图2-5）。也可以用连续划线法。

图2-5 平板划线分离图

（3）培养 将高氏一号培养基和马铃薯蔗糖培养基平板倒置于28℃培养箱中培养3～7d，营养琼脂培养基平板倒置于37℃培养箱中培养1～2d。

（4）挑取菌落 同稀释涂布平板法，获得纯化的微生物菌落。

五、结果与讨论

（1）观察不同的微生物分离纯化方法是否都可获得单菌落。

（2）记录不同平皿上分离得到哪些类群的微生物及其菌落特征。

六、注意事项

分离纯化整个过程中都应保持无菌操作，防止杂菌污染。

思考题

如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？

参考文献

[1]何国庆，贾英民，丁立孝．食品微生物[M].3版．北京：中国农业大学出版社，2016.

[2]郝林，孔庆学，方祥．食品微生物学实验技术[M].3版．北京：中国农业大学出版社，2016.