观察菌落制片及染色结果的细菌形态学实验

一、实验目的

（1）掌握芽孢染色法的原理和操作方法。

（2）学习荚膜染色法，掌握其基本原理。

（3）掌握菌落制片的基本操作方法。

二、实验原理

1.芽孢染色法的原理

利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。芽孢壁比营养细胞的细胞壁致密、透性低，着色、脱色均较困难，因此，一般先用碱性染料如孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体易于区分。

2.荚膜染色法的原理

荚膜是包围在某些细菌胞外的一层黏液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。因荚膜与染料的亲和力弱、不易着色，所以通常用负染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。因荚膜含水量高，故染色时一般不加热固定，以免荚膜变形。

3.菌落制片的原理

放线菌和霉菌都是丝状微生物，为了准确观察其菌丝细胞的形态，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持菌丝在自然生长状态下的形态特征。本实验放线菌的观察采用插片法，霉菌的观察采用载玻片培养法。

①插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长时期的形态。

②载玻片培养法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在盖玻片和载玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

枯草芽孢杆菌培养2d的营养琼脂斜面培养物；褐球固氮菌培养2d的无氮培养基琼脂斜面培养物；链霉菌、黑曲霉、青霉和根霉。

2.仪器

显微镜、木夹子、载玻片、盖玻片、接种环、灭菌平皿、无菌吸管、烧杯、滤纸、U形玻棒、镊子、酒精灯等。

3.试剂

5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、绘图墨水（用滤纸过滤后备用）。

四、实验步骤

1.芽孢染色法——孔雀绿染色法

（1）制片 按常规涂片、干燥、固定。

（2）染色 加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在火焰上微火加热至出现蒸汽并开始计时，4～5min。

（3）水洗 待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。

（4）复染 用番红染液复染2min。

（5）水洗 用缓流水洗后，吸干。

（6）镜检 干燥后油镜观察。芽孢呈绿色，菌体为红色。

2.荚膜染色法——负染色法

（1）制备菌体和墨水的混合液 加1滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。

（2）加盖玻片 将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。

（3）镜检 干燥后用油镜观察，背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现明亮透明圈即为荚膜。(www.xing528.com)

3.菌落制片

（1）插片法

①倒平板：取融化并冷却至约50℃的高氏1号琼脂培养基约20mL倒平板，凝固待用。

②接种：用接种环挑取菌种斜面培养物（孢子）在琼脂平板上划线接种。

③插片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约45°角插入琼脂内（插在接种线上），插片数量可根据需要而定。

④培养：将插片平板倒置，28℃培养，培养时间根据观察的目的而定，通常3～7d。

（2）载玻片培养法

①培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤片，再放一个U形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，见图2-1，盖上皿盖，包扎后于121℃灭菌30min，烘干备用。

图2-1 载玻片培养法示意图

1—平皿 2—U形棒 3—盖玻片 4—培养物 5—载玻片 6—保湿用滤纸

②琼脂块的制作：取已灭菌的马铃薯（或察氏琼脂）培养物6～7mL注入另一灭菌的平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5～1cm²的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块），制作过程应采用无菌操作。

③接种：用尖细的接种针挑取少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。

④培养：先在平皿的滤纸上加3～5mL灭菌的20%甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖，28℃培养3～7d。

五、结果与讨论

观察细菌的芽孢、荚膜的形态特征，并绘制出芽孢、荚膜的形态图。

六、注意事项

（1）荚膜湿墨水染色时，加盖玻片勿留气泡，以免影响观察。

（2）芽孢染色加热时要及时补充染液，切勿让涂片干涸。

（3）插片法倒平板要厚一些，接种时划线要密。

（4）插片时要有一定角度并与划线垂直。

（5）载玻片培养法的接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。

思考题

1.通过墨水法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？

2.为什么芽孢染色要加热？为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色？

3.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少能看到营养细胞，你认为这是什么原因？

4.根据载玻片培养法基本原理，你认为上述操作过程中的哪些步骤可以根据具体情况做一些改进或可用的其他代替方法？

参考文献

[1]中国科学院微生物研究所编写组．常见与常用真菌[M].北京：科学出版社，1973.

[2]魏景超．真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[3]阎逊初．放线菌的分类与鉴定[M].北京：科学出版社，1992.