深入解析革兰染色技术，揭示细菌形态学特征

一、实验目的

（1）掌握革兰染色法的原理和操作方法。

（2）了解革兰染色法在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验原理

革兰染色法将细菌分为革兰阳性和革兰阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和化学组成的不同而决定。当用结晶紫初染时，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘液作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰阳性菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰阴性菌因其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当进行脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

革兰染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物。

2.仪器

显微镜、酒精灯、滴管、烧杯、试管架、滤纸、载玻片、盖玻片、镊子、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸等。

3.试剂

无菌水或无菌生理盐水、革兰染色液（结晶紫液、碘液、95%乙醇、番红染色液）。

四、实验步骤

（1）制片 取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

（2）初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为易）染色1～2min，倾去染色液，水洗至流出水为无色。

（3）媒染 加碘液媒染约1min，水洗。

（4）脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

革兰染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰染色操作的关键环节。脱色不足，革兰阴性菌被误染为革兰阳性菌；脱色过度，革兰阳性菌被误染为革兰阴性菌。脱色时间一般控制在20～30s。(www.xing528.com)

（5）复染 用番红染色液复染约2min，水洗，干燥。

（6）镜检 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰阳性菌（G⁺），被染成红色的为革兰阴性菌（G^-）。

五、结果与讨论

（1）根据观察结果，绘制两种细菌的形态图。

（2）列表简述两株细菌的染色结果（说明各菌的形态、颜色和革兰染色反应）。

六、注意事项

（1）涂片上的菌液不能太浓，且涂抹均匀，否则影响脱色的均匀度及观察结果。

（2）乙醇脱色是革兰染色操作的关键环节，必须严格掌握脱色时间。

思考题

1.哪些环节会影响革兰染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？为什么？

2.进行革兰染色时，为什么强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？

3.现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你染色结果的正确性。

4.简述革兰染色的实验原理。

参考文献

[1]沈萍．微生物学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，1999.

[2]廖延雄．革兰氏染色与革兰氏变性[J].中国兽医科技，2003（5）：73-74.

[3]黄元桐，崔杰．革兰氏染色三步法与质量控制[J].微生物学报，1996，36（1）：76-78.

[4]陈菊滟，陈文娟，赵桂芳．教学用细菌染色方法的改良[J]，微生物学通报，1999，26（2）：128-129.