使用分光光度法测定某物质含量

内容一 721分光光度计

721分光光度计，适用于生物、食品、冶金、化工、机械等领域。它是目前国内企事业单位最常见、应用较广的一种可见分光光度计。721型分光光度计其波长范围是360～800nm，色散元件为三角棱形。

一、实验目的

掌握721分光光度计的原理和使用方法。

二、实验原理

光是一种电磁波，具有一定的波长和频率。可见光的波长范围在400～760nm，紫外光为200～400nm，红外光为760～500000nm。可见光因波长不同呈现不同颜色，这些波长在一定范围内呈现不同颜色的光称单色光。太阳或钨丝等发出的白光是复合光，是各种单色光的混合光。利用棱镜可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等，这就是光谱。有色物质溶液可选择性地吸收一部分可见光的能量而呈现不同颜色，而某些无色物质能特征性地选择紫外光或红外光的能量。物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成吸收光谱，由于物质的分子结构不同，对光的吸收能力不同，因此每种物质都有特定的吸收光谱，而且在一定条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，分光光度法就是利用物质的这种吸收特征对不同物质进行定性或定量分析的方法。

在比色分析中，有色物质溶液颜色的深度决定于入射光的强度、有色物质溶液的浓度及液层的厚度。当一束单色光照射溶液时，入射光强度越强，溶液浓度越大，液层厚度越厚，溶液对光的吸收越多，它们之间的关系，符合物质对光吸收的定量定律，即Lambert-Bear（朗伯—比尔，L-B）定律。根据L-B定律，溶液的吸光度（A）与溶液的浓度（c）的关系应是一条通过原点的直线，称为“标准曲线”。但事实上往往容易发生偏离直线的现象而引起误差，尤其是在高浓度时。这就是分光光度法用于物质定量分析的理论依据。

三、主要特点

721分光光度计采用经典的光路系统和精良的制造工艺，使仪器的测试精度及稳定性较传统产品有很大的提高；广泛适用于冶金、化工、机械、医学、生物、农业、环保、教学等行业和领域。该仪器也是食品厂、饮用水厂办QS认证中的必备检验设备。

四、主要技术指标

波长范围：360～800nm。

波长精度：[（360～600）±3]nm；[（600～700）±6]nm；[（700～800）±8]nm。

透射比正确度：±2.5%。

五、注意事项

（1）该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。

（2）使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮的功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。

六、使用方法

721型分光光度计其波长范围为360～800nm，色散元件为三角棱形。

（1）仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。检查仪器各调节钮的起始位置是否正确，接通电源开关，打开样品室暗箱盖，使电表指针处于“0”位，预热20min后，再选择需要的单色光波长和相应的放大灵敏度挡，用调“0”电位器调整电表为T=0%。

（2）盖上样品室盖使光电管受光，推动试样架拉手，使参比溶液池（溶液装入4/5高度，置第一格）置于光路上，调节100%透射比调节器，使电表指针指T=100%。

（3）重复进行打开样品室盖，调0，盖上样品室盖，调透射比为100%的操作至仪器稳定。

（4）盖上样品室盖，推动试样架拉手，使样品溶液池置于光路上，读出吸光度值。读数后应立即打开样品室盖。

（5）测量完毕，取出比色皿，洗净后倒置于滤纸上晾干。各旋钮置于原来位置，电源开关置于“关”，拔下电源插头。

（6）放大器各档的灵敏度为：“1”×1倍；“2”×10倍；“3”×20倍，灵敏度依次增大。由于单色光波长不同时，光能量不同，需选不同的灵敏度挡。选择原则是在能使参比溶液调到T=100%处时，尽量使用灵敏度较低的挡，以提高仪器的稳定性。改变灵敏度挡后，应重新调“0”和“100”。

（7）空白档可以采用空气空白，蒸馏水空白或其他有色溶液中性吸光玻璃作陪衬。空白调节于100%处，能提高吸光度数以适应溶液的高含量测定。

内容二 二苯碳酰二肼分光光度法测定某物质的铬含量

一、实验目的(www.xing528.com)

学习应用二苯碳酰二肼分光光度法测定某物质的铬含量。

二、实验原理

在酸性介质中，六价铬与二苯碳酰二肼（DPC）反应，生成紫红色络合物，于540nm处进行比色测定。本方法最低检出浓度范围为0.004μg/mL～1.0mg/mL，使用10mm比色皿。

三、水样的预处理

（1）一般清洁水样可直接用高锰酸钾氧化后测定。

（2）对含有大量有机物的水样需进行如下消化处理 取适量水样至于150mL烧杯中，加入5mL HNO₃和3mL H₂SO₄，加热至冒白烟。如果溶液仍有颜色，再加入5mL硝酸重复上述操作至溶液清澈，冷却，用氨水中和溶液的pH至1～2，移入50mL容量瓶中定容混匀。

四、实验步骤

（1）标准曲线绘制

①铬标准储备液：准确称取于120℃下干燥2h的K₂Cr₂O₇基准物0.0283g于100mL烧杯中，用水溶解后转至100mL容量瓶，定容，摇匀。此时Cr（Ⅵ）溶液浓度为0.100mg/mL。

②铬标准操作溶液：用移液管移取铬贮备液0.5mL于50mL容量瓶中，稀释定容得到1.00μg/mLCr（Ⅵ）溶液，临用时配置。

③标准曲线：在7支50mL比色管中，用移液管分别加入0、0.5、1、2、4、7和10mL的1.00μg/mL铬标准液，浓度分别是0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.14、0.2μg/mL。稀释至标线，加入0.6mL硫酸（1∶1）摇匀，再加入2mL二苯碳酰二肼（DPCI）溶液（二苯碳酰二肼微溶于水，溶于热醇、丙酮），立即摇匀，静置5min。以试剂空白为参比溶液，在540nm下测吸光度，绘制吸光度A对六价铬含量的标准曲线。

（2）待测物质铬含量的测定 以试剂空白为参比溶液，在540nm下测该物质吸光度，据OD-C曲线得出Cr（Ⅵ）含量。

五、结果与讨论

计算如式（1-13）所示。

式中 c——Cr⁶⁺含量，mg/L；

m——从标准曲线上查得的Cr⁶⁺含量，μg；

V——水样的体积，mL。

六、注意事项

用于测定铬的玻璃器皿不应用重铬酸钾洗液洗涤。

思考题

二苯碳酰二肼试剂为什么需新鲜配制或贮入冰箱中？

参考文献

[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.

[2]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.

[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.