酵母核糖核酸的分离与组分鉴定实验优化

一、实验目的

了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。

二、实验原理

酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

酵母粉200g。

2.仪器

乳钵、150mL锥形瓶、水浴、量筒、漏斗、吸管、滴管、试管及试管架、烧杯、离心机。

3.试剂

（1）0.04mol/L氢氧化钠溶液1000mL。

（2）酸性乙醇溶液500mL将0.3mL浓盐酸加入30mL乙醇中。

（3）95%乙醇1000mL。

（4）乙醚500mL。

（5）1.5mol/L硫酸溶液200mL。

（6）浓氨水50mL。

（7）0.1mol/L硝酸银溶液50mL。

（8）三氯化铁浓盐酸溶液80mL将2mL 10%三氯化铁溶液（用FeCl₃·6H₂O配制）加入到400mL浓盐酸中。

（9）苔黑酚乙醇溶液10mL溶解6g苔黑酚于100mL 95%乙醇中（可冰箱保存1个月）。

（10）定磷试剂50mL

①17%硫酸溶液：将17mL浓硫酸（相对密度1.84）缓缓加入到83mL水中。

②2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100mL水中。(www.xing528.com)

③10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL水中，贮于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。

临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合：

17%硫酸溶液∶2.5%钼酸铵溶液∶10%抗坏血酸溶液∶水=1∶1∶1∶2（体积比）。

四、实验步骤

将15g酵母悬浮于90mL 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150mL锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。离心（3000r/min）15min，将上清液缓缓倾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（3000r/min）3min。弃去清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。

取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。

（1）嘌呤碱 取水解液1mL加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mo1/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

（2）核糖 取1支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意溶液是否变成绿色，说明是否有核糖的存在。

（3）磷酸 取1支试管，加入水解液1mL和定磷试剂1mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。

注：从酵母中提取核酸部分可由两个学生共做1份。水解及组分鉴定部分由每个学生独立操作。

五、结果与讨论

观察有无嘌呤碱、核糖和磷酸等核糖核酸组分并分析原因。

六、注意事项

（1）离心机中对称放置。

（2）离心管装入样品后必须严格配平。

思考题

1.如何得到高产量RNA的粗制品？

2.本实验RNA组分是什么？怎样验证的？

参考文献

[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.

[2]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.

[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.