分离鉴定十种花菜的核酸

一、实验目的

掌握从菜花中分离核酸的方法，并对核糖核酸（RNA）、脱氧核糖核酸（DNA）做定性检定。

二、实验原理

用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液（10%氯化钠溶液）和0.5mol/L高氯酸溶液（70℃）分别提取DNA和RNA，再进行定性检定。

由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。

1.核糖的测定

测定核糖的常用方法是苔黑酚[即3，5—二羟甲苯法（orcinol反应）]。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5—二羟甲苯在沸水浴中加热10～20min后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3，5—二羟甲苯作用产生绿色物质。

DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。

2.脱氧核糖的测定

测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10min后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω—羟基-6—酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。

此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。

上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA与RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

新鲜菜花1kg。

2.仪器

恒温水浴、电炉、离心机、布氏漏斗装置、吸管、烧杯、量筒、剪刀。

3.试剂

（1）95%乙醇1000mL。

（2）丙酮1000mL。

（3）5%高氯酸1000mL。

（4）0.5mol/L高氯酸溶液100mL。

（5）10%氯化钠溶液1000mL。

（6）粗氯化钠500g。

（7）海砂5g。

（8）二苯胺试剂600mL将6g二苯胺溶于600mL冰醋酸中，再加入16.5mL浓硫酸（置冰箱中可保存6个月。使用前，在室温下摇匀）。

（9）三氯化铁浓盐酸溶液600mL将3mL 10%三氯化铁溶液（FeCl₃·6H₂O配制）加入到600mL浓盐酸中。

（10）苔黑酚乙醇溶液100mL溶解6g苔黑酚于100mL 95%乙醇中（冰箱保存1个月）。

四、实验步骤(www.xing528.com)

（1）核酸的分离

①取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL 95%乙醇和400mg海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。

②滤渣中加入20mL丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。

③再向滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5min后抽干（用力压滤渣，尽量除去丙酮）。

④在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL 5%高氯酸溶液中。搅拌，抽滤，弃去滤液。

⑤将滤渣悬浮于20mL 95%L醇中，抽滤，弃去滤掖。

⑥滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5min，抽滤至干，用力压滤渣尽量除去丙酮。

⑦将干燥的滤渣重新悬浮在40mL 10%氯化钠溶液中。在沸水浴中加热15min。放置，冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并（提取物一）。

⑧将滤渣重新悬浮在20mL 0.5mo1/L高氯酸溶液中。加热到70℃、保温20min（恒温水浴）后抽滤，留滤液（提取物二）。

（2）RNA、DNA的定性检定

①二苯胺反应：如表1-10所示。

表1-10 二苯胺反应

续表

②苔黑酚反应：如表1-11所示。

表1-11 苔黑酚反应

五、结果与讨论

提取物一、提取物二各主要含什么物质？

六、注意事项

（1）溶液应从抽滤瓶上口倒出。

（2）停止抽滤时先旋开安全瓶上的旋塞恢复常压然后关闭抽气泵。

思考题

1.核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质？本实验是怎样除掉的？

2.实验中呈色反应时RNA为什么能产生绿色复合物？DNA产生蓝色物质？

参考文献

[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.

[2]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.

[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.