定性实验：氨基移换反应的实验七

一、实验目的

（1）学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理；

（2）进一步掌握纸层析的原理和操作技术；

（3）了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。

二、实验原理

本实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其他酶所氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。

三、实验材料、仪器与试剂

1.材料

家兔。

2.仪器

解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、表面皿、匀浆器、台秤、离心机、试管及试管架、恒温水浴、毛细玻璃管、直尺、铅笔、层析滤纸、电热鼓风干燥箱、培养皿、层析缸、小烧杯、钉书器、喷雾器。

3.试剂

（1）0.067mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、1%谷氨酸溶液（用氢氧化钾中和至中性）、1%丙酮酸溶液（用氢氧化钾中和至中性）、0.1%碳酸氢钾溶液0.05%碘乙酸溶液、15%三氯乙酸溶液、标准丙氨酸溶液（0.1%）、标准谷氨酸溶液（0.1%）、0.1%水合茚三酮乙醇溶液。

（2）酚溶剂 在大烧杯中，加蒸馏水40mL，再加入新蒸馏的无色苯酚150g在水浴中加热搅拌，混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有100mL蒸馏水的500mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静置7～10h，乳状液变成两层透明的溶液，下层为被水饱和的酚溶液（即酚溶剂），放出下层，贮存在棕色试剂瓶中备用。

四、实验步骤

（1）酶液的制备 将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。用表面皿称取1.5g肝脏，放入匀浆器中，再加入3mL，磷酸缓冲液。研成匀浆后，倒入离心管中，在2500r/min的条件下，离心5min，取上清液，即为制备的酶液。

（2）体外氨基移换反应 取2支试管，编号。向1号管中加入15%三氯乙酸溶液10滴和酶液10滴，混匀，静置15min，作对照管。向2号管中加入酶液10滴，然后向1、2号管中各加入1%谷氨酸溶液10滴、1%丙酮酸溶液10滴、0.1%碳酸氢钾溶液10滴和0.05%碘乙酸溶液5滴，混匀，放入37～40℃恒温水浴中保温1.5～2h。在保温过程中，将试管摇荡几次。保温完毕后取出试管，立即向2号管中加入15%三氯乙酸溶液10滴以沉淀蛋白质，终止酶促反应。将2支试管的内容物分别离心，2500r/min，5min。将上清液转移到试管中，用塞子塞紧，放置于低温处备用。(www.xing528.com)

（3）纸上层析法检查 两人合用一张滤纸（宽15cm，长20cm），如图1-14所示，在其一端距边缘1.5cm处，用铅笔轻画一条与纸边平行的直线作为层析基线，在基线上每隔2cm用铅笔点一小点，共9点。点样时，将毛细管口轻轻触到滤纸上，使每种溶液分别形成直径为2～3mm的圆斑。为了有足够量的样品点在滤纸上，每种溶液应重复点3～4次。每次点样后，待自然风干（或用吹风机吹干），再点下一次，点样量应力求均匀相等。每人4个点和标准丙氨酸1个点。点样后，将滤纸卷成圆筒，用订书机将两端缝合，并留一宽缝，以免接触产生毛细现象。钉好后放入层析罩内，层析装置，如图1-14所示。

图1-14 纸层析示意图

1—层析罩上口磨口塞 2—层析滤纸 3—层析罩 4—平衡溶剂 5—层析缸 6—培养皿

用被酚所饱和的水溶液，平衡20min后，用带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱和酚试剂25mL于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾干。按前述方法显色。

五、结果与讨论

解释得到的层析图谱，计算各种氨基酸的R_f值。

六、注意事项

（1）点样时要避免手指或唾液等污染滤纸。

（2）点样斑点不能太大，直径应小于0.3cm，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠。

（3）展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

思考题

1.什么叫氨基移换（或转氨基）作用？试说明该作用的特点及其在中间代谢中的意义。

2.回顾所做过的生物化学实验，你对于了解生物体组织代谢实验的特点有什么认识和体会？

3.氨基移换反应的定性实验需注意的事项有哪些？

参考文献

滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2009.