内容一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一、实验目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用比移值（Rf移）来表示的，如式（1-4）所示。
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸，如图1-5所示。
图1-5 纸层析图谱
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
氨基酸。
2.仪器
3.试剂
（1）扩展剂（2000mL）4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
（2）氨基酸溶液（各5mL）0.5%赖氨酸（紫色）、脯氨酸（黄色）、亮氨酸（紫色）溶液及它们的混合液（各组分浓度均为0.5%）。
（3）显色剂（1000mL）0.1%水合茚三酮正丁醇溶液（现配最好）。
四、实验步骤
（1）将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
图1-6 点样
（2）取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图1-6所示。
（3）点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。
（4）扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭（注意：一定要密闭，否则迁移不上去）的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升15～20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
（5）显色 用毛刷洒下显色剂，喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5min（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。
五、结果与讨论
计算各种氨基酸的Rf值，如表1-9所示。
表1-9 纸层析结果
六、注意事项
（1）点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。
（2）点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。
思考题
1.何谓纸层析法？
2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？
[1]陈钧辉．生物化学实验[M].4版．北京：科学出版社，2006.
[2]郭蔼光，郭泽坤．生物化学实验技术[M].北京：高等教育出版社，2007.
内容二 纸电泳法分离氨基酸
一、实验目的
（1）掌握纸上电泳的原理。
（2）掌握纸上电泳的操作方法。
二、实验原理
带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在1808年就被发现，但是作为一项生物化学研究的方法学，却是在1937年Tiselius在电泳仪器方面取得重大成就后，才得到较大的进展。特别是后来应用滤纸作为支持物，形成了设备简单、操作方便的纸上电泳法后，电泳技术才在生物化学和其他领域研究中被广泛的应用和发展。近年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置也得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术。
目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用比较广泛，按其支持物物理性状的不同可分成4大类。
（1）滤纸及其他纤维（如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电泳。
（3）粉末电泳 如纤维素粉、淀粉、玻璃分电泳。
区带电泳现已广泛应用于生物化学物质的分析分离以及临床检验等方面。现以纸上电泳为例介绍有关电泳的原理和操作技术。
任一物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其他带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。例如氨基酸、蛋白质分子等，由于它具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，如—COO-和—NH3+等，它是一典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及其溶液的pH和离子强度。在某一pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零。此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这一pH，称为该蛋白质的等电点（pI）。如果溶液的pH小于pI，则蛋白质分子结合一部分H+，而带正电荷，在电场中就会向负极移动。反之，溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出一部分H+而带有负电，此时蛋白质分子在电场中就会向正极移动。如图1-7所示。
图1-7 溶液中蛋白质分子在不同pH时的带电情况
不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率（或称泳动度，mobility）来表示。迁移率的定义是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，如式（1-5）所示。
式中 m——迁移率，cm2/（V·s）；
v——颗粒的泳动速度，cm/s；
E——电场强度，V/cm；
d——颗粒泳动的距离，cm；
L——滤纸的有效长度，cm，即滤纸与两极溶液交界面间的距离；
V——实际电压，V；
t——通电时间，s。
通过测量d、L、v、t便可计算出颗粒的迁移率。
带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量、颗粒的大小和形状有关。一般来说，所带净电荷量越多，颗粒越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快，反之则越慢。泳动速度除受颗粒本身性质的影响外，还和其他外界因素有关。
现将影响颗粒泳动速度的外界因素讨论如下。
1.电场强度
电场强度是指每lcm的电位降，也称电位梯度（电势梯度）。电场强度对泳动速度起着决定性作用。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。例如进行纸上电泳时，滤纸两端相距20cm处测得电位降为200V，则电场强度为200/20=10V/cm。
纸上电泳根据电场强度的大小可分为常压（100～500V）纸上电泳和高压（2000～10000V）纸上电泳，前者电场强度一般为2～10V/cm，分离时间较长，从数小时到数天。后者电场强度为50～200V/cm，电泳时间很短；有时仅需数分钟。常压纸上电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，高压纸上电泳则多用来分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
2.溶液的pH
溶液的pH决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快，反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH，使各种蛋白质所带的电荷量差异较大，有利于彼此分开。为了使电泳过程中溶液pH恒定，必须采用缓冲溶液。
3.溶液的离子强度
离子强度影响颗粒的电动电势（ξ），溶液的离子强度越高，电动电势越小，则泳动速度越慢；反之，则越快。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。溶液离子强度的计算方法如式（1-6）所示。
式中 I——溶液的离子强度；
C——离子的物质的量浓度；
Z——离子的价数。
4.电渗
在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子，使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，称为电渗现象（图1-8）。在纸上电泳中，由于纸上吸附OH-带负电荷，而与纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动，移动时可携带颗粒同时移动。所以电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的泳动速度与由于电渗影响而被携带的移动速度两者的加和。若是颗粒原来向负极移动，则其表观速度将比泳动速度快，若原来向正极移动，则其表观速度将比泳动速度慢。
图1-8 电渗示意图
为了校正这一误差，可用一中性物质如糊精（dextrin）、蔗糖或葡聚糖（dextran）等与样品平行做纸上电泳，然后将其移动距离自实验结果中除去。
5.滤纸的选择
要求纸质均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，使结果不能重复，并得不到好的图谱。如果吸附力大，则蛋白质或其他胶体在它们泳动的过程中有一部分被纸所吸附，以至于泳动快的部分其相对含量低。因此，常将滤纸事先处理，以减低滤纸的吸附能力，使其达到更好的分离效果。若选用国产新华滤纸，或Whatman No.1号滤纸，一般不必再进行预处理。
6.其他因素
例如缓冲溶液的黏度。缓冲溶液与带电颗粒的相互作用以及电泳时温度的变化等因素，也都影响泳动速度。
本实验以混合氨基酸为材料，用纸上电泳法分离其中的不同氨基酸。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
氨基酸。
2.仪器
水平式电泳槽、电泳仪、吹风机、点样器、喷雾器、铅笔、刀片、杭州新华滤纸或Whatman No.1号滤纸。
3.试剂
（1）1/15mol/L磷酸盐缓冲液（离子强度0.08，pH 6.0）5000mL。
（2）丙氨酸（pI=6.02）、谷氨酸（pI=3.22）、赖氨酸（pI=9.74）混合液（各1%）100mL。
（3）显色液（茚三酮）。
四、实验步骤
（1）仪器及样品的准备 将电泳槽洗净，晾干、放平。然后量取700～800mL缓冲液先倒入电泳槽，使两端液面达到平衡。
（2）滤纸的剪裁 用刀片将新华滤纸或Whatman No.1号滤纸，裁成长10cm、宽2cm的滤纸条，并按以下规格用铅笔作上正负记号（图1-9）。
图1-9 滤纸剪裁示意图
剪裁前要选择纸质比较均匀的纸，用刀片裁整齐，注意纸边不能有缺刻或起毛，可先用废纸条练习，然后再正式裁剪。
（3）点样
①原点的位置和形状：对于一个未知样品，初次实验时，应将样品点在滤纸条的中央，观察区带的两极泳动情况，即可选择出点样位置。
样品可点成长条形，或圆点状。一般长条形分离效果较好，但样品很少时，点成圆点，样品比较集中，便于显色。但双向电泳或一向电泳、一向层析结合使用时则必须点成圆点或椭圆点，不能点成长条形。
②点样量：随滤纸的厚度、原点的宽度、样品的溶解度、显色方法的灵敏度、样品迁移率的差异而有所不同。样品量过多时拖尾和扩散比较严重，不能获得最有效的分离。样品量太少时，将无法检出。
③点样方法：可分干点法和湿点法两种。
湿点法：先将滤纸用喷雾器均匀地喷上缓冲液，或将滤纸浸于缓冲液中，浸透后取出，夹在两普通滤纸中，轻压，将多余缓冲液吸去。缓冲液与干纸质量比为1.2∶（1～2.5）∶1。然后架起滤纸，在纸上用点样管将样品画成长条形。注意画线要直，且粗细均匀，千万不可将滤纸画毛，损伤纸面。以湿点法点样品时，点的次数不宜多，因此，如果样品浓度较低时，必须事先浓缩。
干点法：将样品点于纸上，待第一次样品晾干，再点第二次。画线必须细直，粗细均匀，直到将所需要的样品全部点完为止。可用吹风机冷风加速干燥，而后小心地用喷雾器将滤纸两端喷湿，有样品处空出，让其缓冲液经扩散而自行湿润，或将滤纸除样品部分外浸于缓冲液中，放置片刻，样品部分靠毛细管作用而湿润，多余缓冲液可用普通滤纸吸去。
干点法和湿点法各有利弊，干点法虽然在点样过程中起浓缩作用，但点的次数多时，纸面容易受损，样品干坏。湿点法虽不宜用作稀的样品，却可保持样品的天然状态。
点样前，可用废滤纸条先以水代替样品进行练习，当操作熟练后再正式点样。
（4）电泳 将滤纸架放入电泳槽中，标有正号的一端应放在正极槽内，负号的一端放在负极槽内，并把滤纸条拉紧，使其成为平面，避免中间下垂。
盖上玻璃盖，关闭电泳槽中间活塞，检查好线路。然后打开电源开关，调整电压到250V左右，并观察或测量其电流数值，记下通电时间。
为了计算迁移率，要用万用电表测量滤纸的有效长度两端的实际电压，记下读数。
（5）烘干 通电0.5h后，关闭电源开关，在滤纸与溶液交界处作上记号（以便测量长度L），然后将滤纸条由滤纸架上取下，分别平插在具有两排细针的木架上（图1-10）放入105℃烘箱中烘干15min；或吹干。
图1-10 滤纸示意图
（6）染色 用喷雾器对滤纸均匀喷洒显色剂。
（7）吹干至出现斑点。
五、结果与讨论
绘出结果图，指出各斑点的氨基酸酸碱性质并说明你判断的依据。(www.xing528.com)
六、注意事项
在纸电泳中，由于滤纸常含有一定量的氨基而带负电荷，使其与纸相接触的水溶液带正电荷，使液体向负极移动。此时，粒子实际电泳的速度是粒子本身电泳速度与由于水溶液移动而产生电渗速度的迭加。因此，若粒子原来向负极移动，则表面速度将比电泳速度快；若原来向正极移动，则表面速度将比电泳速度慢。所以，中性物质有时在电场中也可能向负极移动。
思考题
纸电泳分离物氨基酸的原理是什么？
参考文献
[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法．生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.
[2]李巧枝，程绎南．生物化学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.
内容三 DNS-Cl法测定N末端氨基酸
用于N末端分析的方法很多，下面介绍几种最常用的方法。
1.二硝基氟苯（DNFB）法
多肽或蛋白质的游离末端-NH2与DNFB（称Sanger试剂）反应后，生成二硝基苯酚（DNP）—多肽或DNP—蛋白质。由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP—多肽经酸水解后，只有N末端氨基酸为黄色DNP—氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。只要鉴别所生成的DNP—氨基酸，便可得知多肽链的N末端残基。虽然多肽侧链上的ε-NH2、酚-OH等也能与DNFB反应，但生成的侧链DNP衍生物，如α-DNP赖氨酸当用有机溶剂（如乙酸乙酯）抽提时将与游离氨基酸一起留在水相，因而容易和α-DNP氨基酸区分开来。待分析的DNP—氨基酸可用纸层析、薄层层析或HPLC进行分离鉴定和定量测定。
2.丹磺酰氯（DNS）法
丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS）是5-（二甲氨基）萘-1—磺酰氯的简称。此方法的原理与DNFB法相同。只是用DNS代替DNFB试剂。由于丹磺酰基具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS—氨基酸不需要提取，可直接用纸层析或薄层层析加以鉴定。
3.苯异硫氰酸酯（PITC）法
多肽或蛋白质的末端氨基也和氨基酸的α—氨基一样能与PITC（Edman试剂）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，简称苯氨基硫甲酰（PTC）—多肽或蛋白质。后者在酸性有机溶剂中加热时，N末端的P TC—氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，因为P TC基的引入只使第一个键的稳定性降低。反应液中代表N末端残基的苯基海硫因（PTH）—氨基酸，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层析（如硅胶薄膜或聚酰胺薄膜等）、气相色谱或高效液相色谱等进行鉴定。
4.氨肽酶法
氨肽酶（amino peptidase）是一类肽链外切酶（exopeptidase）或称作外肽酶，它们能从多肽链的N末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N末端残基序列。实际上，此法用于测定N末端和末端残基序列有许多困难，因为酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断哪个残基在前，哪个残基在后。
由于荧光试剂二甲氨基茶磺酰氯（dansyl-Cl，DNS-Cl）方法测定N末端氨基酸相对其他方法具有灵敏度高，操作简单，实验中所得的DNS—氨基酸更稳定，且耐酸水解等优点。所以本实验采用DNS-Cl法测定N末端氨基酸。
一、实验目的
（1）掌握DNS-Cl法测定N末端氨基酸的原理和方法。
（2）掌握用聚酰胺薄膜分析和鉴定DNS—氨基酸的方法。
二、实验原理
DNS-Cl在碱性条件下与氨基酸（肽或蛋白质）的氨基结合成带有荧光的DNS—氨基酸（DNS—肽或DNS—蛋白质）DNS—肽和DNS—蛋白质再经酸水解可释放出DNS—氨基酸，其反应式如图1-11所示。
DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中，赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10-10～10-9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将P ITC法和DNS法结合起来（称为P ITC-DNS法）应用于蛋白质结构的序列分析工作，可以提高P ITC法的灵敏度及其分析速度。DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22h，除DNS—色氨酸全部被破坏，DNS—脯氨酸（77%）、丝氨酸（35%）、甘氨酸（18%）、丙氨酸（7%）部分被破坏外，其余DNS—氨基酸很少被破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成和N末端分析。
DNS-Cl与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε—氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε—赖氨酸和DNS-O—酪氨酸较稳定，同时还有DNS—双—赖氨酸和DNS—双—酪氨酸生成，展层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α—氨基酸有区别。
图1-11 DNS-Cl反应
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH（图1-12）。
图1-12 DNS-Cl水解反应
在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2。DNS—氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开（图1-13）。
DNS—氨基酸在酸性条件下（pH 2～3）一般都可被乙酸乙酯抽提，然后取乙酸乙酯层点样层析，这样大量DNS-Cl的反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层析图谱清晰。但若是DNS—精氨酸、DNS—天冬氨酸、DNS—谷氨酸、DNS—苏氨酸、DNS—丝氨酸，则它们大部分或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致得出错误结论。这时可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述DNS—氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的右侧，影响不大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。
DNS—氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01μg（相当于10-10mol）。聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术。由于它具有灵敏度高、分辨率强、快速、操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。在用于分析测定氨基酸衍生物方面超过了过去使用的纸层析、纸电泳、硅胶薄板层析等方法。
图1-13 DNS-Cl过量反应
聚酰胺（polyamide）是一类称为锦纶或尼龙的化学纤维原料，此类高分子物质含有大量的酰胺基团，故统称为聚酰胺。酰胺基团能同酚类、酸类、醌类以及硝基化合物等极性物质形成氢键。聚酰胺对被分离物质吸附能力的大小取决于二者之间氢键的强弱。在层析中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。选择适当的展层溶剂，可使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异，经过吸附与解吸附的展层过程，就会形成一个分离顺序，达到离析的目的。聚酰胺固定于涤纶片基或其他载片上而形成一种质地均匀紧密的多孔薄膜结构即聚酰胺薄膜。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
猪胰岛素。
2.仪器
（1）聚酰胺薄膜 可以反复使用，层析后用丙酮和25%～28%浓氨水（9∶1，体积比），或用丙酮和90%甲酸（9∶1，体积比）浸泡6h。把污物洗去，再用甲醇洗涤，晾干后使用。
（2）小干燥器或小钟罩、真空干燥器、具塞磨口试管（5mL）及指形样品管、毛细管、水解管、烘箱、紫外灯、细长滴管。
3.试剂
（1）6mol/L盐酸溶液。
（2）0.2mol/L碳酸氢钠水溶液。
（3）DNS-Cl溶液 取25mg DNS-Cl溶于10mL，丙酮中。
（4）溶剂系统a甲酸（85%～90%）∶水=1.5∶100（体积比）。
（5）溶剂系统b苯∶乙酸=9∶1（体积比）。
（6）标准Gly（2.3mg/mL）和标准Phe（4.6mg/mL），均用0.2mol/L碳酸氢钠缓冲液配制。
四、实验步骤
（1）标准DNS—氨基酸的制备 称取0.2～0.3mg标准氨基酸溶于0.5mL，0.2mol/L碳酸氢钠溶液中，取0.1mL加入细长的小试管中，加入0.1mL DNS-Cl丙酮溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液调其pH达9.5～10.5，用胶布封住试管口，室温（20～25℃）放置3～4h。反应毕，用电吹风热风吹除丙酮，用1mol/ L的盐酸溶液调其pH至2.0～3.0，加入乙酸乙酯，摇匀，静止分层后，在上层的乙酸乙酯溶液中含有标准DNS—氨基酸。对于测定胰岛素的N末端氨基酸，可制备DNS-Gly及DNS-P he。
（2）DNS—胰岛素的制备及水解 取30μL胰岛素溶液置水解管中，加入30μL DNS-Cl丙酮溶液，用封口膜封口，37℃保温1h。反应完毕后，用水泵抽气抽去丙酮，加入100μL 6mol/L盐酸，使盐酸的终浓度为6mol/L。水解管在抽真空情况下，用煤气灯封口，置110℃恒温箱保温16～18h。开管，将水解管置于沸水浴上用水泵抽气抽去盐酸，直至盐酸完全挥发干净。再加2～3滴蒸馏水溶解，水浴蒸干，重复2次，以除尽盐酸。最后加1～2滴乙酸乙酯，溶解样品。
（3）DNS—氨基酸的聚酰胺薄膜层析
①聚酰胺薄膜的选择：7cm×7cm，质地均匀的薄膜。
②点样：用一端平齐的毛细管取样点在左下角距两边各为1cm处，样点直径不超过2mm，若需多次点样，需在第一次样品吹干后再点第二次。用铅笔或在薄膜的水平方向作展层第Ⅰ相的记号Ⅰ，再在垂直方向作展层第Ⅱ相的记号Ⅱ。
③展层：准备几个小密闭容器，如干燥器，再准备几个小培养皿，放入各个密闭容器中，调成水平。向每个小培养皿中各倒入约6mL的展层溶剂，使溶剂的高度不超过3mm。将容器密闭，使溶剂蒸汽在容器内达到饱和。
将点好样的聚酰胺薄膜Ⅰ方向朝上，光面朝外，聚酰胺面向内，箍一个尼龙条圈或照相底片圈（用1mol/L氢氧化钠溶液煮过），垂直放入盛有溶剂系统a的小培养皿内，盖上容器盖子，此时溶剂沿薄膜上移，进行层析。待溶剂前沿距顶端约0.5cm时，取出薄膜，用电吹风充分吹干。然后将薄膜改换成Ⅱ的方向向上，在溶剂系统b中进行第Ⅱ相层析。
本实验每人可以做3张聚酰胺薄膜的双相层析。
第一张：胰岛素DNS化样品。
第二张：标准DNS-Gly和DNS-P he样品。
第三张：胰岛素DNS化样品加上标准P he和DNS-Gly化样品。即在胰岛素DNS化样品点样后，吹干，在此位置上，重叠点上P he和DNS-Gly化样品。
五、结果与讨论
将吹干后的薄膜置于254nm或256nm的紫外线灯下观察，用铅笔圈出DNS化氨基酸所显示的荧光斑点，对上面3张图谱进行对比，确定出胰岛素的N末端氨基酸。
六、注意事项
（1）样品水解必须完全。水解后，样品管中的盐酸必须尽可能除尽，否则将影响点样及层析。
（2）点样用毛细管，管口要磨平，以避免点样时损坏薄膜。点样斑点直径以1～2mm为宜，点样后用冷风吹干，再继续点样，直至点样量满足要求。即在紫外线（UV）灯下，可见明显黄色荧光斑点。
（3）溶剂系统b层析前，务必将薄膜充分吹干，否则在Ⅱ相层析时溶剂不能上行，分离效果不好。
（4）层析所用器材必须干燥，溶剂系统配制要正确。
（5）第Ⅰ相层析后，可在UV灯下检查分离效果，但动作要快，避免生成DNS—磺酸式副产物。
思考题
1.DNS-Cl法测定N末端氨基酸具有哪些优点？
2.DNS-Cl法则定N末端氨基酸时可能出现哪些副反应？
3.DNS-Cl法测定N末端氨基酸需注意哪些事项？
参考文献
[1]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.
[2]陈钧辉，李俊．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.
内容四 甲醛滴定法测定氨基酸含量
一、实验目的
掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、实验原理
氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：
H3N+—R—COO-⇔ H2N—R—COO-+H+
—
是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定—
所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。
常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使—NH—+3释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH 9.0左右）。因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量（脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。酪氨酸的滴定毫升数偏高）。如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。
三、实验材料、仪器与试剂
1.材料
甘氨酸。
2.仪器
25mL锥形瓶、3mL微量滴定管、吸管。
3.试剂
（1）0.1mol/L标准甘氨酸溶液300mL准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100mL。
（2）0.1mo1/L标准氢氧化钠溶液500mL（标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮存在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。）
（3）酚酞指示剂20mL。
（4）0.5%酚酞的50%乙醇溶液100mL。
（5）中性甲醛溶液400mL在50mL 36%～37%分析纯甲醛溶液中加入1mL 0.1%酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定到微红，贮存于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。
四、实验步骤
（1）取3个25mL的锥形瓶，编号。向1、2号瓶内各加入2mL，0.1mo1/L的标准甘氨酸溶液和5mL水，混匀。向3号瓶内加入7mL水。然后向3个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液，再混匀，分别用0.1mo1/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的体积（mL）。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率，如式（1-7）所示。
式（1-7）中实际测得量为滴定1、2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液体积（mL）的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液体积（mL）之差乘以标准氢氧化钠的物质的量浓度，再乘以14.008。2mL乘以标准甘氨酸的物质的量浓度再乘以14.008，即为加入理论量的毫克数。
（2）取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数，如式（1-8）所示。
式中 A——滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均体积，mL；
B——滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均体积，mL；
cNaOH——标准氢氧化钠溶液的真实物质的量浓度，mol/L。
五、结果与讨论
记录实验结果。
六、注意事项
利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。
思考题
选用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基？
参考文献
[1]魏群．基础生物化学实验[M].3版．北京：高等教育出版社，2009.
[2]滕利荣，孟庆繁．生物学基础实验教程[M].3版．北京：科学出版社，2008.
[3]陈钧辉，陶力，李俊，等．生物化学实验[M].3版．北京：科学出版社，2003.
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